이 프로토콜은 DNA 커튼 기술이 염색질 역학을 연구하는 방법, 특히 히스톤 샤페론의 분자 기능을 조사하는 방법을 보여줍니다. 고처리량 단일 분자 이미징 기술 DNA 커튼은 대량 실험의 한계를 극복하고 실시간 이미징을 용이하게 하여 생체 분자 상호 작용의 상세한 특성 분석을 가능하게 합니다. 양면 테이프의 중앙에 치수 5 x 35mm의 깨끗한 용지를 놓습니다.
슬라이드 위에 테이프를 부착하여 두 개의 구멍과 나노 패턴을 종이로 덮습니다. 그런 다음 깨끗한 칼날을 사용하여 종이를 절제하십시오. 양면 테이프 위에 유리 커버 슬립을 놓고 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 문질러 미세유체 챔버를 형성합니다.
조립된 플로우 셀을 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 놓고 클립으로 고정합니다. 플로우 셀을 섭씨 120도의 진공 오븐에서 45분 동안 굽습니다. 핫 글루건을 사용하여 칩 기반 분석을 위한 유체 커넥터를 열린 각 구멍에 부착합니다.
그리고 두 줄의 루어 잠금 튜브를 연결하십시오. 탈이온수 3밀리리터가 들어 있는 루어 잠금 주사기를 연결하고 챔버를 세척합니다. 드롭 바이 드롭 연결을 통해 3m리터의 지질 완충액으로 챔버를 다시 세척합니다.
지질 완충액에 0.04x 비오틴화 지질 1mL를 챔버에 2회 주입하고 샷당 5분 동안 배양합니다. 스트렙타비딘 1밀리리터당 0.025밀리그램을 BSA 1밀리리터에 2회 주입하고 10분 동안 배양합니다. BSA 완충액 1밀리리터에 약 30피코몰의 비오틴화된 람다 파지 DNA를 챔버에 2회 주입하고 10분씩 배양합니다.
10mL의 이미징 버퍼가 들어 있는 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 미세유체 시스템의 모든 튜브 라인에서 기포를 제거합니다. drop-to-drop 연결을 통해 준비된 플로우 셀을 미세유체 시스템과 연결하여 플로우 셀에 기포가 주입되는 것을 방지합니다. 플로우 셀(flow cell)과 플로우 셀(flow cell) 홀더를 조립하고, 맞춤형으로 제작된 전반사 형광 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)에 어셈블리를 장착합니다.
100 마이크로리터의 샘플 루프를 통해 이미징 버퍼에 200 마이크로리터의 YOYO-1 염료를 주입하여 Lambda DNA 분자를 염색합니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고 488나노미터 레이저를 켜서 DNA 커튼이 잘 형성되었는지 확인합니다. YOYO-1 염료를 제거한 후, 미리 배양된 단백질 시료를 주입합니다.
단백질이 DNA 커튼에 도달하면 주사기 펌프를 끄고 차단 밸브를 끄고 Abo1에 의한 히스톤 로딩을 위해 15분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 Abo1과 히스톤 단백질을 5분 동안 씻어냅니다. 히스톤 단백질이 DNA에 로드되었는지 확인하기 위해 버퍼 흐름을 일시적으로 끕니다.
DNA 커튼 형성은 보간 염료로 DNA 분자를 염색하여 확인했습니다. 평행 배열로 표시된 녹색 선은 DNA 분자에 삽입된 YOYO1이 유체역학적 흐름 하에서 확산 장벽에서 잘 정렬되고 늘어났음을 나타냅니다. Abo1이 없는 상태에서 Cy5-H3-H4 이량체를 DNA 커튼에 주입했을 때, Cy5-H3-H4는 DNA에 결합하지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 DNA에 자발적으로 결합하지 않았음을 나타냅니다.
Cy5-H3-H4에 Abo1을 주입했을 때 DNA 분자에서 적색 형광 반점이 보였는데, 이는 Abo1이 H3-H4 이량체를 DNA에 로드한다는 것을 시사합니다. 형광 신호는 완충액 흐름이 없을 때 사라졌다가 흐름이 재개되었을 때 다시 나타나 H3-H4 이량체가 DNA에 결합한다는 것을 시사합니다. H3-H4 이량체가 DNA에 결합하는 것은 카이모그래프에 의해서도 확인되었는데, 이 카이모그래프에서는 흐름이 꺼질 때마다 형광 신호가 사라졌습니다.
뉴클레오티드가 없거나 ADP가 있는 경우 DNA 커튼에 형광 반점이 거의 나타나지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 Apo 상태 또는 ADP의 존재 하에서 DNA에 거의 결합하지 않음을 나타냅니다. 정량 분석은 DNA에 결합된 H3-H4 이량체의 수가 ATP의 존재 하에서 증가한다는 것을 보여줍니다. 결과는 ATP 가수분해가 Abo1에 의해 DNA에 H3-H4 로딩에 필수적임을 시사합니다.
플로우 셀(flow cell)에 기포가 주입되는 것을 방지하는 것이 모든 단계에서 가장 중요합니다. 따라서 이 프로토콜에서는 드롭 바이 드롭 연결을 강조합니다. DNA 커튼 분석은 이중 나노 패턴이 있는 이중 테더 DNA 커튼으로 확장할 수 있습니다.
또한 단일 가닥 DNA, RNA 또는 액틴 필라멘트로 다른 유형의 DNA 커튼을 만들 수 있습니다. DNA 커튼은 DNA의 단백질 움직임을 시각화하고 표적 검색 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 합니다. DNA 커튼은 복제 및 전사를 포함한 DNA 대사를 연구하기 위해 확장될 수 있습니다.
