Этот протокол показывает, как метод ДНК-занавеса используется для изучения динамики хроматина, в частности, для изучения молекулярной функции шаперонов гистонов. Высокопроизводительная технология визуализации одной молекулы ДНК позволяет преодолевать ограничения массовых экспериментов и облегчает визуализацию в режиме реального времени, позволяя детально характеризовать взаимодействия биомолекул. Положите чистую бумагу размером 5 на 35 миллиметров на центр двустороннего скотча.
Прикрепите ленту к слайду, чтобы закрыть бумагой два отверстия и нано-узоры. Затем удалите бумагу чистым лезвием. Положите стеклянный покровный листок поверх двустороннего скотча и потрите покровный лист с помощью наконечника пипетки, чтобы образовалась микрофлюидная камера.
Поместите собранную проточную ячейку между двумя предметными стеклами микроскопа и закрепите их. Выпекайте проточную ячейку в вакуумной духовке при температуре 120 градусов Цельсия в течение 45 минут. Прикрепите жидкостный соединитель для анализа на основе стружки к каждому открытому отверстию с помощью пистолета для горячего клея.
И соедините две линии трубки замка приманки. Подсоедините шприц с фиксатором приманки, содержащий три миллилитра деионизированной воды, и промойте камеру. Снова промойте камеру тремя миллилитрами липидного буфера по капле.
Введите один миллилитр 0,04-кратного биотинилированного липида в липидном буфере в камеру за два приема с пятиминутной инкубацией на каждый выстрел. Вводят 0,025 миллиграмма на миллилитр стрептавидина в один миллилитр БСА с двумя уколами и 10-минутной инкубацией на один укол. Введите примерно 30 пикомоларов биотинилированной лямбда-фаговой ДНК в один миллилитр буфера BSA в камеру двумя выстрелами и 10-минутной инкубацией за укол.
Подсоедините шприц, содержащий 10 миллилитров буфера для визуализации, к шприцевому насосу и удалите пузырьки во всех трубках микрофлюидной системы. Соедините подготовленную проточную кювету с микрофлюидной системой с помощью соединения «капля к капле», чтобы избежать впрыска пузырьков в проточную ячейку. Соберите проточную ячейку и держатели проточной ячейки и установите узел на изготовленный по индивидуальному заказу флуоресцентный микроскоп с полным внутренним отражением.
Введите 200 микролитров красителя YOYO-1 в буфер визуализации через 100 микролитров петли образца для окрашивания молекул лямбда-ДНК. Запустите программное обеспечение для визуализации и включите лазер с длиной волны 488 нанометров, чтобы проверить, правильно ли сформированы занавески ДНК. После удаления красителя YOYO-1 введите предварительно инкубированный образец белка.
Когда белки достигнут завесы ДНК, выключите шприцевой насос, закройте запорный клапан и инкубируйте в течение 15 минут для загрузки гистонов Abo1. Промывают несвязанные белки Abo1 и гистоны в течение пяти минут. Временно отключите буферный поток, чтобы проверить, загружены ли белки гистонов в ДНК.
Образование ДНК-занавеса проверяли путем окрашивания молекул ДНК интерполирующим красителем. Зеленые линии, показанные в параллельных массивах, указывали на то, что YOYO1, интеркалированный в молекулы ДНК, был хорошо выровнен и растянут на диффузионном барьере под действием гидродинамического потока. Когда димеры Cy5-H3-H4 вводились в занавес ДНК в отсутствие Abo1, Cy5-H3-H4 не связывались с ДНК, что указывает на отсутствие спонтанного связывания димеров H3-H4 с ДНК.
Когда Cy5-H3-H4 был введен Abo1, на молекулах ДНК были замечены красные флуоресцентные пунктуры, что позволяет предположить, что Abo1 загружает димеры H3-H4 на ДНК. Флуоресцентные сигналы исчезали в отсутствие буферного потока и появлялись вновь, когда поток возобновлялся, что позволяет предположить, что димеры H3-H4 связываются с ДНК. Связывание димеров H3-H4 с ДНК также было подтверждено кимографом, в котором сигналы флуоресценции исчезали всякий раз, когда поток отключался.
В занавесе ДНК появлялось мало флуоресцентных пунктатов либо в отсутствие нуклеотида, либо в присутствии АДФ, что указывает на то, что димеры Н3-Н4 редко связываются с ДНК, либо в состоянии Apo, либо в присутствии АДФ. Количественный анализ показывает, что количество димеров H3-H4, связанных с ДНК, увеличивается в присутствии АТФ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидролиз АТФ необходим для загрузки H3-H4 на ДНК Abo1.
Предотвращение впрыска пузырьков в проточную ячейку является наиболее важным на всех этапах. Поэтому в этом протоколе мы делаем акцент на соединениях по капле. Анализ ДНК-занавеса может быть расширен до двойных ДНК-занавесок с двойными нанопаттернами.
Кроме того, мы можем создать другой тип ДНК-занавеса с одноцепочечными ДНК, РНК или актиновыми филаментами. Занавес ДНК позволяет визуализировать движение белка на ДНК и облегчает изучение механизма поиска мишеней. Занавес ДНК может быть расширен для изучения метаболизма ДНК, включая репликацию и транскрипцию.
