Este protocolo mostra como a técnica de cortina de DNA é utilizada para estudar a dinâmica da cromatina, em particular investigando a função molecular de chaperonas de histonas. A técnica de imagem de molécula única de alto rendimento A cortina de DNA supera as limitações dos experimentos em massa e facilita a obtenção de imagens em tempo real, permitindo a caracterização detalhada das interações da Biomolécula. Coloque um papel limpo de dimensão 5 por 35 milímetros no centro da fita dupla face.
Fixe a fita sobre a lâmina para cobrir os dois orifícios e nano padrões com o papel. Em seguida, extire o papel usando uma lâmina limpa. Coloque uma tampa de vidro por cima da fita dupla face e esfregue a tampa usando uma ponta de pipeta para formar uma câmara microfluídica.
Coloque a célula de fluxo montada entre duas lâminas do microscópio e corte-as. Asse a célula de fluxo em forno a vácuo a 120 graus Celsius por 45 minutos. Conecte o conector de fluido para a análise baseada em chip a cada orifício aberto usando uma pistola de cola quente.
E conecte as duas linhas de tubulação de bloqueio de isca. Conecte uma seringa de bloqueio de isca contendo três mililitros de água deionizada e lave a câmara. Lave novamente a câmara com três mililitros de tampão lipídico através de conexão gota a gota.
Injetar um mililitro de lipídio biotinilado 0,04x em tampão lipídico, na câmara, em dois disparos, com incubação de cinco minutos por disparo. Injetar 0,025 miligramas por mililitro de estreptavidina em um mililitro de BSA, com duas injeções, e uma incubação de 10 minutos por injeção. Injetar aproximadamente 30 picomolares de DNA de fagos lambda biotinilados em um mililitro de tampão BSA, na câmara com dois tiros e incubações de 10 minutos por disparo.
Conecte uma seringa contendo 10 mililitros de tampão de imagem a uma bomba de seringa e remova bolhas em todas as linhas de tubulação no sistema microfluídico. Junte a célula de fluxo preparada com o sistema microfluídico através de conexão gota-a-gota para evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo. Monte a célula de fluxo e os suportes de célula de fluxo e monte o conjunto em um microscópio de fluorescência de reflexão interna total construído sob medida.
Injetar 200 microlitros de corante YOYO-1 em tampão de imagem através de 100 microlitros de alça de amostra para corar moléculas de DNA Lambda. Execute um software de imagem e ligue o laser de 488 nanômetros para verificar se as cortinas de DNA estão bem formadas. Após a remoção do corante YOYO-1, injete a amostra de proteína pré-incubada.
Quando as proteínas atingirem a cortina de DNA, desligue a bomba da seringa, desligue a válvula de desligamento e incube por 15 minutos para carregamento de histona por Abo1. Lave as proteínas Abo1 e histonas não ligadas por cinco minutos. Desligue transitoriamente o fluxo tampão para verificar se as proteínas de histona estão carregadas no DNA.
A formação de cortinas de DNA foi verificada pela coloração de moléculas de DNA com um corante interpolador. Linhas verdes mostradas em arranjos paralelos indicaram que YOYO1 intercalado em moléculas de DNA estavam bem alinhadas e esticadas em uma barreira de difusão sob fluxo hidrodinâmico. Quando dímeros Cy5-H3-H4 foram injetados na cortina de DNA na ausência de Abo1, Cy5-H3-H4 não se ligou ao DNA, indicando uma falta de ligação espontânea dos dímeros H3-H4 ao DNA.
Quando Cy5-H3-H4 foi injetado com Abo1, puncta fluorescentes vermelhos foram vistos em moléculas de DNA, sugerindo que Abo1 carrega dímeros H3-H4 no DNA. Os sinais fluorescentes desapareceram na ausência de fluxo tampão e reapareceram quando o fluxo foi retomado, sugerindo que dímeros H3-H4 se ligam ao DNA. A ligação dos dímeros H3-H4 ao DNA também foi confirmada pelo quimógrafo, no qual os sinais de fluorescência desapareciam sempre que o fluxo era desligado.
Poucos pontos fluorescentes apareceram na cortina de DNA, seja na ausência de nucleotídeo ou na presença de ADP, indicando que dímeros H3-H4 raramente se ligam ao DNA, seja no estado Apo ou na presença de ADP. A análise quantitativa mostra que o número de dímeros H3-H4 ligados ao DNA aumenta na presença de ATP. Os resultados sugerem que a hidrólise de ATP é essencial para a carga de H3-H4 no DNA por Abo1.
Evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo é o mais crítico para todas as etapas. Então, neste protocolo, enfatizamos as conexões gota a gota. O ensaio de cortina de DNA pode ser estendido para cortinas de DNA de dupla amarração com nanopadrões duplos.
Além disso, podemos fazer outro tipo de cortina de DNA com filamentos de DNA de fita simples, RNA ou actina. A cortina de DNA permite a visualização do movimento da proteína no DNA e facilita o estudo do mecanismo de busca de alvos. A cortina de DNA pode ser estendida para estudar o metabolismo do DNA, incluindo replicação e transcrição.
