Bu çalışmada sıçan intrapulmoner arter ve vasküler düz kas hücrelerinin izole edilmesi anlatılmaktadır. İntrapulmoner arterin vasküler yanıtını araştırmak için organ banyosu tekniğini kullanmak gibi çeşitli deneysel protokoller kullanılmıştır. İntrapulmoner arterler ve vasküler düz kas hücreleri, vasküler fizyoloji ve patofizyolojiyi incelemek için mükemmel modellerdir.
Bu tekniğin adaptasyonları, herhangi bir ilacın, ekstraktın veya fitokimyasalın vasküler yanıtlarını değerlendirebilir. İzole intrapulmoner arteriyel halkanın bir organ banyosuna monte edilmesi, bir ilacın pulmoner hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların modülasyonundaki rolünü değerlendirmek için izole intrapulmoner arterlerin kullanılmasını sağlar. Deneysel protokoller teknik olarak uygulanabilir, ancak önemli adımlar karmaşık ve başarı için gereklidir, bu nedenle görsel bir gösterime sahip olmak anlamayı ve takip etmeyi kolaylaştırır.
Prosedürü gösteren, Naresuan Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü, Kardiyovasküler Araştırma Birimi Laboratuvarı'ndan fizyoloji alanında yüksek lisans öğrencisi olan Kittiwoot To-on olacak. Akciğerin tek bir lobunu 11 santimetrelik makasla dilimleyerek ve medial tarafı veya akciğerin kökü yukarı bakacak şekilde dokuz santimetrelik bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Damar, bronş ve arterin yukarıdan aşağıya hizalanmasını gözlemleyin ve tanımlayın.
Bronşu makasla uzunlamasına kesin. Ardından bronşun ucunu tutmak için 11 santimetrelik forseps kullanın. Bronş ve damarları yavaşça disseke edin ve akciğerden çıkarın.
İntrapulmoner arterin ucunu tutmak için forsepsleri kullanın ve makasla akciğer dokusundan dikkatlice diseke edin. İzole intrapulmoner arteri, organ banyosu düzeneği kurulana kadar soğuk Krebs çözeltisinde tutun. İntrapulmoner arteri izole ettikten sonra, intrapulmoner arterin ana dalını 11 santimetrelik makasla uzunlamasına kesin ve iki milimetrelik şeritler halinde kesin.
İntrapulmoner arter şeritlerini DM'ye batırın, daha sonra şeritleri mililitre papain,% 0.04 BSA ve% 0.4 milimolar DTT içeren DM'de dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. DM'de mililitre kollajenaz Tip IA başına bir miligram ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin.
Dokuları taze DM'ye aktarın ve bir cam Pasteur pipet kullanarak nazik tritürasyonla dağıtın. İzole vasküler düz kas hücreleri mikroskop altında banyo çözeltisinde görünür hale gelene kadar tritürasyona devam edin. Daha önce gösterildiği gibi intrapulmoner arteri izole edin ve intrapulmoner arterin ana dalını yaklaşık iki milimetre uzunluğundaki halkalara kesin.
İntrapulmoner arter halkalarını organ banyosu odacıklarına 40 mikrometre çapında iki paslanmaz çelik tel üzerine geçirerek yapıştırın. İntrapulmoner arter halkaları ile monte edilmiş paslanmaz çelik telleri, veri toplama cihazına bağlı izometrik kuvvet dönüştürücülere ve veri kaydı ve analizi için uygun fizyolojik yazılımla kurulan bilgisayar sistemine takın. Daha sonra intrapulmoner arter halkasının gerginliğini yavaşça bir grama yükseltin.
Damar segmentlerinin bir gramlık bir dinlenme geriliminde yaklaşık 45 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Dengeleme süresi boyunca, Krebs çözeltisinin her 15 dakikada bir düzenli olarak değiştirildiğinden emin olun. Dengeden sonra, yüksek hücre dışı potasyum çözeltisine vazokonstriksiyonlarını ölçerek damarların yaşayabilirliğini test edin.
PE ile önceden kontrakte edilmiş halkalarda asetilkoline gevşeme yanıtını hesaplayarak endotel varlığını veya yokluğunu değerlendirin. Denudasyonu indüklemek için kabın içini küçük bir telle hafifçe ovalayarak endoteli mekanik olarak çıkarın. Daha sonra test deneylerinin başlamasından önce arteriyel halkaları 30 dakika boyunca dengeleyin. Bitki ekstraktının gevşetici etkisini, intrapulmoner arter halkalarını PE ile önceden daraltarak araştırın. Daha sonra, vazogevşemeyi indüklemek ve konsantrasyona bağlı bir yanıt eğrisi elde etmek için bitki ekstraktının mililitresi başına 0.1 ila 1000 mikrogramı dikkatlice endotel bozulmamış halkalara ve endotel ile indüklenmiş halkalara kümülatif olarak ekleyin.
Bir çözücü olarak kullanılan etkili DMSO'nun da negatif kontrol görevi görecek şekilde benzer şekilde değerlendirildiğinden emin olun. Metin yazısında belirtildiği gibi bitki ekstraktının vazogevşetici etki mekanizmasını değerlendirir. Daha sonra PE stabilize için kasılmalardan sonra, bitki ekstraktının kümülatif konsantrasyonlarını ekleyin.
İnhibitörlerin varlığında intrapulmoner arter halkalarının inhibitörlerin varlığında gevşeme yüzdesi olarak bitki ekstresinin etkilerini, inhibitörsüz intrapulmoner arter halkalarının yanıtına kıyasla sunar ve konsantrasyon yanıt eğrisini oluşturur. Endotel sağlam intrapulmoner arterde, bitki ekstresi vazoresyonun konsantrasyona bağımlı bir yanıtını ortaya çıkardı. Endotelin eradikasyonu, EC50'deki artışın 2.2 kat artmasıyla yansıtıldığı gibi, bitki ekstraktının neden olduğu vazogevşemeyi derinden azalttı, eNOS ve EDHF'nin inhibisyonu bitki ekstraktına verilen vazorelaxant tepkisini açıkça azalttı.
Bu, konsantrasyon tepki eğrisini sağa kaydırdı ve E max değerlerini değiştirmeden EC50'yi artırdı. Aksine, Indometazin, bitki ekstraktına vazogevşetici yanıt üzerinde hiçbir etki göstermedi. Endotel ile indüklenmiş intrapulmoner arter halkalarında, kalsiyum ile aktive edilen potasyum kanal blokerleri, bitki ekstraktına vazogevşetici yanıtı azaltmıştır.
Voltaj kapılı veya ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının blokerleri ise sapma göstermedi. Bitki özü ile ön inkübasyon, kalsiyum-klorür kaynaklı kasılmayı inhibe etti. Endotel ile indüklenen intrapulmoner arter halkaları, kalsiyum içermeyen Krebs solüsyonu ve PE ile önceden inkübe edilerek geçici bir kasılma meydana getirdi.
Araca kıyasla, bitki özleri PE tarafından indüklenen büzülmeyi önemli ölçüde azaltmıştır. İşlem sırasında, damar, bronş ve arteri erken yaşta açıkça tanımlamalıdır. Arterin kesilmesi veya zarar görmesi, uzunluğunu azaltacak ve vasküler yanıtları etkileyecektir. Bu teknik, pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkların tedavisi için prototip görevi görebilecek bileşikleri araştırmak için uyarlanabilir.
