Bu çalışma NIH HL109478 (KNF) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar izole ve kültür PASMC korunmasında kabul ve yardım için Gina Kim ve Joann Taylor teşekkür ederim.

Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu bu protokolü onayladı. 1. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Day One <ol><li> 100 ml (nihai konsantrasyon =% 20) ısı ile deaktive edilmiş FBS ve 5 ml (nihai konsantrasyon =% 1) Penisilin / Streptomisin ile karıştırın 400 ml M199 - Komple M199 ortamı hazırlayın. </li><li> 5 ml (nihai konsantrasyon =% 1) Penisilin / Streptomisin ile karıştırın 500 ml M199 - serum serbest M199 ortamı hazırlayın. </li><li> Mix 0.05 g agaroz artı 10 ml steril, serum serbest M199 medya 0.05 g demir parçacıkları - PA Agaroz hazırlayın. </li><li> 10 ml steril, serumsuz M199 ortamı içinde karıştırın, 0.1 g agarozun - Akciğer agaroz hazırlayın. </li><li> Steril filtre Bu karışım daha sonra 80 U / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda, steril, serum içermeyen ortam ile karışır M199 kolajenaz ve - kollajenaz hazırlayın. </li&gt; <li> Fare ötenazi önce vaktinden tüm donanımları kurmak. </li><li> Fare ötenazi hemen önce kaynamaya PA agaroz ve akciğer agaroz ayarlayın. </li><li> Izofluran doz aşımı ile anestezi kavanoza fare Euthanize ve izofluran ile temas için fare yavru izin vermemek için dikkatli olun. En iyi hücre verimi hücrelerin ölümünden sonra dolaşımda oluşturan mikro pıhtılar önlemek için ölümden hemen sonra hasat zaman elde edilir. </li><li> Anestezi kavanoz fareyi çıkarın, işletim kartına fare güvenli ve fare, aletler ve alkol ile eldiven sterilize edin. </li><li> Bıçak ile neşter yükleyin ve boyun alt karın için fareyi insizyon. </li><li> Farenizin sol tarafta karın açın, böbrek maruz ve fare böylece akciğerlerin küçük damarlarda pıhtı kaçınarak, asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​sağlamak için renal arter kesti. </li><li> En farenin sol tarafında kesmek için makas kullanınsternum toraks açmak için. </li><li> Dikkatle her iki tarafta da diyafram kesilmiş ve tam göğüs boşluğu açmak için neşter kullanmak. Göğüs boşluğuna açık tutmak için forseps veya işaretçilerine kullanın. </li><li> PA yönelik bir 27 G ½ inç iğne ile RV sopa ve akciğer (tüm kan pulmoner dolaşım dışına kızarmış) beyaz görünmesini kadar steril PBS ile RV / PA / akciğer serpmek. Bu fare büyüklüğüne bağlı olarak PBS içinde yaklaşık 3-5 ml alacaktır. Bu, küçük bir akciğer damarlarında pıhtı oluşumunu önlemek için ilk fışkırma için önemlidir. </li><li> Dikkatlice trakea ve iplik bir dikiş altında ortaya çıkarmak için künt diseksiyon kullanın. </li><li> Destek için trakea altındaki küçük forseps koyun ve trakea içine 24 G angiocatheter yerleştirin. IV yerleştirme gibi angiocatheter yerleştirin. </li><li> Adım 1.16 olarak dişli dikiş ile trakea içine angiocatheter sabitleyin. </li><li> Kaynar su dışında kaynar Pensilvanya agaroz alın ve iyice karıştırın için ters. Agaro soğutunSE buz üzerinde dönen yaklaşık vücut sıcaklığına getirilir. Agaroz çözeltide kalır ama bu PA hücrelere zarar verir, böylece sıcak olmayacak gerekmektedir. </li><li> Bir 27 G ½ inç iğne ile RV sopa ve akciğer gri görünür kadar PA agaroz ile RV / PA / akciğer serpmek. Agaroz karışımı demir parçacıklar akciğer gri renkli görünür hale getirecek. Bu fare büyüklüğüne bağlı olarak, PA agaroz yaklaşık 3-5 ml alacaktır. Bu demir solunum yollarına akmasına neden olabilir çok hızlı enjekte yavaş yavaş gitmek için de önemlidir. </li><li> Kaynar su akciğer agaroz çıkarın ve iyice karıştırın için ters. Daha sonra buz üzerinde dönen yaklaşık vücut sıcaklığına soğumaya agaroz. Agaroz çözeltide kalır ama bu da, akciğer hücrelerine zarar böylece sıcak olmayacak gerekmektedir. </li><li> Akciğer agaroz hazırlamak ve trakea içinde 24 G angiocatheter için şırınga takın. Tam olarak akciğer şişirmek için trakea yoluyla agaroz demlenmeye. Akciğerler easie olacakr akciğer uygun şişirilmiş ise (daha sonra adımlara bakın) kıyma için. </li><li> Kalp-akciğer blok çıkarın ve batığın bu agaroz (~ 5 dk) katılaşmaya buz PBS 25 ml içine. Cerrahi alan temizlemek için bu kez kullanın. </li><li> Yenidoğan fareler için (P7-P21), en iyi PASMC verim hücrelerin tek bir grupta 2-3 yavrular bir araya geliyor. PASMC optimum hücre sağlık ve büyümesi için diğer hücreler ile temas halinde olması tercih ederler. Bir fare izolasyon başına kullanılırsa, o zaman hücreler, seyrek ve iyi büyümez. Birlikte hayvanlar, hasat ve soğuk kalp-akciğer blokları birleştirerek ve tüm kalp-akciğer blok hayvanlardan kaldırıldı kez daha sonra kıyma için taşıdığınızda. </li><li> Bu noktadan itibaren kısırlık için hücre kültürü kaputu taşı. </li><li> 10 cm doku kültürü çanak kapağı içine soğutulmuş akciğer yerleştirin ve dikkatli bir şekilde kalp, timus, trakea ve akciğer herhangi bir bağ dokusu çıkarın. </li><li> 10 cm doku kültürü çanak alt karşı akciğerlerde hareketve yaklaşık 1 ml buz gibi soğuk steril PBS ilave edin. </li><li> 2 neşter ile çok küçük parçalar (1-2 mm) içine akciğer kıyma. </li><li> Steril bir 5 ml serolojik pipet kapalı ucu kırın. Pipet steril 50 ml konik tüp içine akciğer bulamaç kıyılmış. Akciğer dokusunun tüm 50 ml konik tüp içine alır sigortalamak için plaka yıkamak için ek steril buz gibi soğuk PBS kullanın. </li><li> Mıknatıs üzerine 50 ml konik tüp yerleştirin. Demir içeren doku mıknatıs yanında borunun yan taşımak için bekleyin. Akciğer dokusuna demir içeren geminin oranına bağlı olarak, gemilerin bazıları hala bu noktada yüzen olabilir. Bu gemilerin içeriyorsa belli olduğu için PBS yavaş ve dikkatli bir şekilde yüzen akciğer dokusu aspire etmemeye çalışıyor kapalı aspire. </li><li> Tekrar aspire edilir akciğer dokusunun miktarını en aza indirmek için çalışıyor, 5 ml steril PBS ile akciğer pelet 3x yıkayın. </li><li> 3 ml kollajenaz içinde akciğer pelet tekrar süspansiyon ve 60 mm doku kültürü çanak içine dökün. YapmaBu pipetle için çalışalım, akciğer parçaları da pipet iç sadık olacaktır. </li><li> Boşaltma işleminin hemen sonrasında boru durulama ve hem de 60 mm doku kültürü çanağı içine dökmek için bu, fazladan bir 3 ml kullanın. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C doku kültürü inkübatör içine yerleştirin. </li><li> Pipet doku + 5 ml şırınga bir 15 G künt iğne ile kollajenaz bulamaç yukarı ve aşağı tüm büyük akciğer parçaları bozulur kadar. Doku + kollajenaz çamur görünür doku parçaları ile bu noktada bulutlu olacak. </li><li> Yeni bir steril 50 ml konik tüp içine dökün ve mıknatıs eklemek. </li><li> Dokunun tüm toplanan edilmiş olmasını sağlamak için tam M199 ortamın yaklaşık 5 ml doku kültürü bulaşık yıkama, ve konik bir tüp içine bu dökün. </li><li> Kollajenaz + medya süpernatant kapalı aspire. Bu süre çok az yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında olacaktır. </li><li> 5 ml tam Med ile yıkayınız3x ia. Bu kollajenaz inaktive etmek için gereklidir. </li><li> Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve. </li><li> 35 mm doku kültürü çanak içine süspanse pelet dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları olacaktır. </li><li> Gecede doku kültürü inkübatör doku kültürü çanak (plaka sıfır etiketli) yerleştirin. Plaka sıfır üzerine kapalı geçirmek için ilk hücreleri düz kas işaretleri için boyama dayalı yaklaşık% 50 fibroblast ve% 50 PASMC vardır. Bu plaka kaplama sıfır denir ve sonuçta sonraki zenginleştirme basamakları sonra atılır. </li></ol> 2. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - İkinci Gün <ol><li> Temiz bir 50 ml konik tüp içine plaka sıfırdan süpernatant medya dökün. </li><li> Medya süpernatant aspire. Bu zaman hemen hemen hiç uçuşan cisimler olabilir ve kompakt bir demir-conta olacakadencilik pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır. </li><li> 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın. </li><li> Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve. </li><li> 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu (Şekil 1A) plaka biri olacaktır. </li><li> Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin. </li></ol> 3. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Altı <ol><li> Temiz bir 50 ml konik tüp içine plaka birinden süpernatant medya dökün. Bu adımı birden çok kez tekrar damar duvarında ikamet düz kas hücrelerinin her bir hücre kültürü plaka üzerine kapalı geçirmek için bir fırsat olduğunu sigortalanır. Her plaka yani her adımda bir azalan dönüş daha az ve daha az hücre bağlı olacaktır vardır. </li><liGeri doku kültürü inkübatör içine tam M199 medya, ve yer ile&gt; tekrar çember yükleme özelliği plaka bir. </li><li> Medya süpernatant aspire. Bu zaman neredeyse hiçbir yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır. </li><li> 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın. </li><li> Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve. </li><li> 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu plaka iki olacaktır. </li><li> Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin. </li></ol> 4. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Dokuz <ol><li> Doku kültürü çanak plaka iki temiz bir 50 ml konik bir tüp içine medya süpernatant dökün. </li><li> Tekrar çember yükleme özelliği tam M199 medya ile plaka iki ve yerine geri doku kültürü içineinkübatör. </li><li> Medya süpernatant aspire. Bu zaman neredeyse hiçbir yüzen cisimlerin olacak ve kompakt bir demir-içeren pelet mıknatıs yanındaki konik tüp tarafında oluşturacaktır. </li><li> 5 ml tam ortam 3x ile yıkayın. </li><li> Eksiksiz bir medya 3 ml ekleyin ve demir içeren pelet tekrar süspansiyon birkaç kez aşağı karıştırmak ve. </li><li> 35 mm doku kültürü çanak içine dökün. Bir mikroskop kullanılarak, damar lümen bulunan demir parçacıkları etrafında yüzen küçük kap parçaları görülür. Bu plaka üç olacak. </li><li> Doku kültürü inkübatöründe doku kültür tabağına yerleştirin. </li></ol> 5. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Thirteen <ol><li> 1-3 plakaların medya kapalı aspire. </li><li> Yavaşça sıcak, steril PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> Hücrelerini trypsinize için her plakaya tripsin (~ 0.25-0.5 ml) tripsin ince bir tabaka ekleyin. Hücreler çok yapışık ve doku cultu içinde tripsin olması gerekirplaka çıkarmak için yaklaşık 10 dakika inkübatör yeniden. </li><li> Herhangi bir kalıntı demir partikülleri çekmek için mıknatıs bağlı bir 50 ml konik tüp içinde 5 ml tam ortama plakalar Hasat hücreleri. </li><li> Tam ortam ilave 0.5 mL &#39;si ile plakaların her yıkayın ve 50 ml konik tüp, medya ekleyin. </li><li> Bu kez, medya süpernatant (aspire yok) almak ve demir parçacık pelet atın. </li><li> Plaka 60 mm tabak içinde 5 ml tam M199 medya hücreleri birkaç gün içinde konfluent hücreler olması. Alternatif olarak, plaka 10 ml tam M199 10 cm plaka medya ve PASMC hücrelerin izdiham ulaşmak için yaklaşık bir 1-2 hafta sürer. </li></ol> 6. Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter İzolasyon - Gün Ondört <ol><li> Herhangi bir kalıntı tripsin kaldırmak için taze tam M199 medya için ortam değiştirin. Doku kültürü çanak (Şekil 1B) üzerinde PASMC ince bir nüfus olacak. </li></ol> 7. Rutin Bakım <ol><li> Taze tam M199 medya için ortam değiştirin yaklaşık haftada 2x. </li><li> Bu hücreler, tripsin bir film inkübatör yaklaşık 10 dakika (0.25-0.5 ml) bir plaka çıkarmak için hücrelerin bölünme gerekli olduğunda. Tripsin filmi kullanarak hücrelerin aşağı sıkma yapmadan PASMC bir replating sağlar. Çok fazla tripsin kullanılırsa, o zaman PASMC tripsin üzerinden dönmeye santrifüj gerekir, veya hücre plakasına readhere olmayacaktır. Bazen, hücreleri aşağı iplik sonra, tam M199 medya içine yeniden süspanse PASMC almak zordur. </li><li> Gözlemler, izole edilmiş PASMC 4-5 geçişleri için güvenilir düz kas hücreleri gibi davranırlar, ama düz kas hücre geçişi 7 kadar işaretleme kalemler için izole hücreleri leke olacaktır. Geçit 2 (tripsin ilk maruz kaldıktan sonra kaplama) olarak günde on üç ilk toplanmış 60 mm ya da 10 cm plaka sayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+the+pulmonary+vascular+bed+in+fetal+lambs.">Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs.</a> Circulation. 53, 144-151 (1976).</li><li>Walsh-Sukys, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn+in+the+era+before+nitric+oxide:+practice+variation+and+outcomes.">Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes.</a> Pediatrics. 105, 14-20 (2000).</li><li>Khemani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+hypertension+in+formerly+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia:+clinical+features+and+outcomes+in+the+surfactant+era.">Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era.</a> Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).</li><li>Jobe, A. H., Bancalari, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchopulmonary+dysplasia.">Bronchopulmonary dysplasia.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).</li><li>Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+echocardiography+for+the+diagnosis+and+management+of+pulmonary+vascular+disease+in+young+children+with+chronic+lung+disease.">Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease.</a> Pediatrics. 121, 317-325 (2008).</li><li>Check, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+growth+restriction+and+pulmonary+hypertension+in+premature+infants+with+bronchopulmonary+dysplasia.">Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia.</a> J. Perinatol. , (2013).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+increases+phosphodiesterase+5+expression+and+activity+in+ovine+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 102, 226-233 (2008).</li><li>Aschner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+synthase+gene+transfer+enhances+dilation+of+newborn+piglet+pulmonary+arteries.">Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries.</a> Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).</li><li>Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hypoxia+increases+cytosolic+calcium+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).</li><li>Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+activation+by+hypoxia+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+is+age+and+site+specific.">RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific.</a> Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).</li><li>Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibroblast+growth+factor-2+expression+in+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells+involves+increased+reactive+oxygen+species+generation.">Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).</li><li>Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturational+shift+from+PKCzeta+and+voltage-gated+K++channels+to+RhoA/Rho+kinase+in+pulmonary+vasoconstriction.">Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction.</a> Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).</li><li>Wedgwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+regulates+extracellular+superoxide+dismutase+activity+and+expression+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension.</a> Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidant+stress+increases+PDE5+activity+in+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).</li><li>Chester, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinaciguat,+a+soluble+guanylate+cyclase+activator,+augments+cGMP+after+oxidative+stress+and+causes+pulmonary+vasodilation+in+neonatal+pulmonary+hypertension.">Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).</li><li>Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+voltage+gated+potassium+channel+responses+in+a+fetal+lamb+model+of+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).</li><li>Olschewski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+K(Ca)+channel+to+membrane+potential+and+O2+sensitivity+is+decreased+in+an+ovine+PPHN+model.">Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).</li><li>Aslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+lung+injury+in+a+murine+model+of+neonatal+chronic+lung+disease.">Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).</li><li>Balasubramaniam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+angiogenic+cells+restore+lung+alveolar+and+vascular+structure+after+neonatal+hyperoxia+in+infant+mice.">Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase-4+inhibition+attenuates+pulmonary+inflammation+in+neonatal+lung+injury.">Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury.</a> Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).</li><li>de Visser, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+attenuates+pulmonary+inflammation+and+fibrin+deposition,+mortality+and+right+ventricular+hypertrophy+in+neonatal+hyperoxic+lung+injury.">Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury.</a> Respir. 10, 30 (2009).</li><li>Ladha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+improves+alveolar+growth+and+pulmonary+hypertension+in+hyperoxia-induced+lung+injury.">Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury.</a> Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+hyperoxia+increases+mitochondrial+oxidation+and+increases+phosphodiesterase+5+activity+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106, 526-535 (2010).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Generated+at+Mitochondrial+Complex+III+Triggers+Acute+Responses+to+Hypoxia+in+the+Pulmonary+Circulation.">Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).</li><li>Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+NADPH-oxidase+is+activated+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu yazıda, ilk kez P7, P14, ve P21 de farelerden alınan PASMC en izolasyonu için tarif. Bunu gerçekleştirmek için, agaroz ve 0.2 uM demir zerrelerin bir bulamacı PA içine RV ile infüze edilir. Demir parçacıkları küçük boyutu nedeniyle, pulmoner kapiller yatak geçemez ve böylece küçük PA yatırılır. Akciğerler, şişirilmiş kaldırılır ve ayrışmış vardır. Demir içeren gemilerin bir mıknatıs kullanarak çözüm çıkardı vardır. Sonuçta, gemilerin bir doku kültürü çanak içine kapl...

Plasenta gaz değişimi en önemli organı olarak hizmet verir ve kalp debisi sadece% 10 pulmoner vasküler yatak dolaşıyor yana Pulmoner hipertansiyon intrauterin ömrü boyunca normaldir. Utero olarak, akciğer basıncı yüksek pulmoner vasküler direnç nedeniyle sistemik basınçları benzer . Gebelik ilerledikçe, akciğer içindeki küçük PA hızlı büyüme doğum 1 gerçekleşir pulmoner kan akımında dramatik artış için fetus hazırlanıyor vardır. Normal perinatal geçiş kısa vadeli ve tam süreli bebeklerde başarısız olduğunda, sonuç (PPHN) yenidoğanın persistan pulmoner hipertansiyon. PPHN çok farklı altta yatan patolojiler neden olduğu bir klinik sendromdur. Ancak, bu bebeklerin tüm bu duktus arteriozus veya için kalıcı fetal bağlantıları arasındaki bu yüksek pulmoner vasküler direnç, hipoksemi ve kan akımının sağdan sola şant gibi ortak patofizyolojik özellikleri paylaşmakovale amin. PPHN 1000 canlı doğumda 2-6 etkiler ve ölüm gibi önemli kısa vadeli ve uzun vadeli morbidite 2 bir% 8-10 risk taşır. Ayrıca, çok düşük doğum ağırlıklı prematüre bebeklerde altta yatan akciğer hastalığı sonucu pulmoner hipertansiyon gelişebilir. Prematüre bebeklerde en sık altta yatan akciğer hastalığı bronkopulmoner displazi (BPD) &#39;dir. BPD genel risk gebelik yaşı ve doğum ağırlığı ile ilişkilidir ise bu bebeklerin bir alt kümesi önemli pulmoner hipertansiyon ve nasıl uygun bu bebeklerin tedavisinde geliştirir neden, belirsizliğini koruyor. Uzun süreli hastanede kalış ve artan ölüm de dahil olmak üzere kötü sonuçlar, 3-6 yaygındır. Tarihsel olarak, sağlıklı hayvanlardan alınan koyun veya domuz fetal PASMC fetal PASMC doğumdan sonra normal pulmoner vasküler geçiş dahil sinyal yollarının incelemek için kullanılmıştır. Bunlar, tipik olarak, bir beşinci nesli direnç PA izole edilirn koyun ya da herhangi bir spontan solunum 7-9 önce teslim ve ötenazi domuz fetus. Ayrıca, bazı araştırmacılar izole ve biraz büyük gelen PASMC kullanılan ve kendiliğinden 3 gün, 2 hafta ve 4 hafta 10-12 kuzu ve domuz nefes var. Daha yakın zamanda, bazı grupları başarıyla izole edilmiş ve hastalık durumunun 13-17 yolaklarının sinyalizasyon bozuklukların incelemek PPHN Kuzuların izole PASMC faydalanmaktadır. Bu hücreler sinyal yolları normal ve hastalıklı kısa vadeli ve dönem pulmoner vasküler hem de çok önemli olan incelemek için değerli bir araç olduğu görüldü. Ancak, pulmoner hipertansiyon ile prematüre bebeklerde etkiledi sinyal yolları hakkında fikir vermeyin. Ne de hastalığın fare modellerinde görülen genetik manipülasyon olanakları izin veriyoruz. Sıçan ve fare modelleri uzun modeli BPB için kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda modeli pulmoner hy için kullanılmaktadırBPD 18-22 kaynaklanan pertension. Yenidoğan sıçan onların büyük boyutu nedeniyle çalışmak için cazip, ama onlar da genetik modifikasyon için potansiyel eksikliği muzdarip. Genetiği değiştirilmiş hayvanlar kapsamlı yenidoğan farelerde bütün hayvan fizyolojisi ile ilgili özel gen hedefleri etkilerini araştırmak için, ama kimse daha önce başarılı bir şekilde bu küçük fareler PASMC izole bugüne kadar kullanılmıştır. PASMC izole ederek, daha fazla bilgi yolları çevresel uyaranlara ve / veya pulmoner arter düz kas özellikle genetik modifikasyon yanıt olarak nasıl değiştiğini hakkında elde edilebilir. Ayrıca, canlı PASMC kalsiyum ve reaktif oksijen türleri 23-25 ​​gibi önemli sinyal molekülleri hızlı değişiklikleri incelemek için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Son zamanlarda Marshall et al, tekniğin bir varyasyonu kullanılarak erişkin farelerden elde edilen PASMC başarılı bir şekilde izole edilmesi tarif. 26 sıçan PASMC 23,25,26 izole etmek için kullanılabilir. Şimdi bir adapte olmasınd 7-21 gün yaş küçük fareler (P7, P14, ve P21) için bu tekniği uzatıldı. Bu yeni PASMC izolasyon tekniği için birincil sınırlama bu deneyler için yeterli hücre elde etmek için birden fazla farenin gerektirir ve hücrelerin, birincil düz kas hücrelerinin karakteristik olan, çok yavaş bir şekilde bu olmasıdır. Bu kısıtlamalara rağmen, biz yenidoğan fare PASMC izole etmek için bu tekniği pulmoner hipertansiyon gelişiminde rol oynadığı ve bu alanda önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir önemli sinyal yollarının gelişmiş soruşturma için izin inanıyoruz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

Pulmoner hipertansiyon morbidite ve bebeklerde mortalite önemli bir nedenidir. Tarihsel olarak, fetal koyun PASMC vasküler düz kas kasılması yer alan sinyal yollarının önemli bir çalışma olmuştur. Koyun vadeli pulmoner hipertansiyon mükemmel bir model yaparken, çok pahalı ve farelerde bulunan genetik manipülasyon avantajı eksikliği. Tersine, fareler PASMC izole etmek yetersizlik, bu sistemin önemli bir sınırlama oldu. Burada Marshall et al daha önce anlatılan tekniğin bir varyasyonu kullanılarak P7, P14 ve P21 farelerden fare PASMC birincil kültürleri izole edilmesi tarif. 26 önceden sıçan PASMC izole etmek için kullanılır oldu. Bu fare PASMC yenidoğan döneminde sinyal yolları çalışmaları için yeni bir araç temsil eder. Kısaca,% 0.5 &#39;lik bir çamur (ağ / hac) agaroz + M199 ortamı içinde% 0.5 demir partikülleri, sağ ventrikül (RV) ile pulmoner vasküler yatak içine aşılanmıştır.demir parçacıkları çapı 0.2 mcM ve pulmoner kapiller yatak geçemez. Böylece, küçük pulmoner arter (PA) demir zâviye. Akciğerler kaldırıldı ve ayrışmış agaroz, şişirilir. Demir içeren gemiler bir mıknatıs ile aşağı çekilir. Kolajenaz (80 U / ml) daha fazla işleme ve ayrışma sonra kaplar kültür kabı üzerine hücre göçü izin vermek için% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler (M199 tam kültür ortamı) ihtiva eden M199 ortamı içinde, bir doku kültürü kabı içine konur . Bu hücre ilk plaka fibroblastlar ve PASMC bir 50-50 karışımıdır. Bu nedenle, prosedür aşağı çekme bir daha saf PASMC nüfus elde etmek ve herhangi bir kalıntı demir kaldırmak için birden çok kez tekrarlanır. Düz kas hücre kimlik düz kas miyozin ve desmin için immün ile teyit edilir.

Izolasyon sırasında ve sonrasında, PASMC ışık mikroskobunda ve düz kas hücre belirteçleri için immün her iki incelenir. Erken protokolde ışık mikroskobu ile, PASMC gemiler (Şekil 1A) içeren küçük demir doku kültürü çanak üzerine göç görülür. Gün on üç on plakalar üç ile bir havuzu sonra, daha sonra demir parçacıkları bu son havuzu adımda çıkardı edilmiş olarak artık değerlendirildiğini biliyoruz. Bunun yerine, PASMC nüfusu doku kültürü çanak (Şe...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice at JoVE.com

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

isolation-of-pulmonary-artery-smooth-muscle-cells-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Görüntüleme.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.

Video: Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Biyoloji

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...