Bu protokol, mitokondriyal hastalıkları incelemek için beyin organoidlerini kullanmayı amaçlamaktadır. Mitokondriyal özelliklerinin değerlendirilmesinde tekrarlanabilir beyin organoidleri üretmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem pahalı biyoreaktörler ve zaman alıcı gömme prosedürleri gerektirmez.
Bu nedenle, uygulanması ve lüks olması kolaydır. Bu protokol, tekrarlanabilir beyin organoidleri üretmeyi ve mitokondriyal özelliklerini test etmeyi mümkün kılar. Bu, tedavi edilemeyen mitokondri hastalıkları için girişimsel hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir.
Başlangıç olarak, iPSC ortamında besleyici içermeyen koşullar altında insan iPSC'lerini kaplanmış altı kuyulu plakalarda kültürleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe tutun. IPSC'leri% 80 iklüzumda, bire dört ila 12 arasında değişen oranlarda enzimsiz kopma ortamını kullanarak geçiştirin. Hücre sağkalımini artırmak için, her bölünmeden sonra 10 mikromoler rho ilişkili protein kinaz veya ROCK inhibitörü ekleyin.
%80 iPSC'leri sıfır gününde ayrıştırın. Kortikal farklılaşma ortamını bir veya CDM1 hazırlayın ve hücrelere eklemeden önce oda sıcaklığında önceden ısıtın. Ölü hücreleri ve kalıntıları gidermek için iPSC'leri içeren kuyuları PBS ile yıkayın.
Her kuyuya 500 mikrolitre önceden ısıtılmış reaktif A ekleyin ve 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Hücre müfrezesini sağlamak için mikroskobun altına bakın. Aktivitesini nötralize etmek için reaktif A'yı seyreltmek için bir mililitre iPSC ortamı ekleyin.
Yukarı ve aşağı boru yaparak hücreleri ayrıştırmak ve hücre süspansiyonu 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarmak için 1.000 mikrolitre pipet kullanın. IPSC'leri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 125 kez G'de hafifçe santrifüjleyin, ardından hücre peletini bozmamak için süpernatantı dikkatlice emiş edin. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve hücre numarasını saymak için peletı bir mililitre CDM1 ile yeniden kullanın.
CDM1'de 20 mikromolar KAYA inhibitörü, üç mikromoler WNT catenin inhibitörü veya IWR-1 ve beş mikromolar SB-431542 ile desteklenmiş 100 mikrolitre başına 9.000 iPSC ile tohumlama ortamını hazırlayın. 96 kuyulu V alt plakaya kuyu başına 100 mikrolitre tohumlama ortamı ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte nemli bir doku kültürü inkübatöründe tutun.
Nörosferler oluşturmak için, ilk gün, tanımlanmış pürüzsüz kenarlıklara sahip yuvarlak hücre agregalarının oluştuğunu gözlemleyin. Agregaların etrafındaki ölü hücrelere dikkat edin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatörde kültüre devam edin.
Üçüncü gün, ölü hücreleri ayırmak için yanlara üç kez dokunarak plakayı ajite edin, ardından her kuyuya 20 mikromoler ROCK inhibitörü, üç mikromoler IWR-1 ve beş mikromoler SB-431542 ile desteklenmiş 100 mikrolitre CDM1 ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte inkübatörde tutun. Altıncı günde, her kuyudan 80 mikrolitreyi dikkatlice çıkarın.
Kuyunun dibine dokunmaktan kaçının. Her kuyuya üç mikromoler IWR-1 ve beş mikromoler SB-431542 ile desteklenmiş 100 mikrolitre CDM1 ekleyin ve plakayı kuluçkaya yatırın. Önceki adımı 18.
18. günde, nörosferleri aktarmak için CDM2'yi hazırlayın ve 100 milimetre ultra düşük ek hücre kültür plakasına 10 mililitre ekleyin. Yuvarlak nörosferleri 96 kuyu plakasından 100 milimetre ultra düşük ek hücre kültürü plakasına aktarmak için ucu kesilmiş 200 mikrolitre pipet kullanın. Nörosferleri içeren plakadan beş mililitre orta çıkarın ve beş mililitre taze CDM2 ekleyin.
Plakayı, 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde dakikada 70 dönüşte bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin. Her üç günde bir, süpernatant ortamını dikkatlice emiş ve yeni CDM2 ile değiştirin. Nörosferlerin kurumasını önlemek için az miktarda ortam bırakın.
35. günde CDM3'ü hazırlayın. Aracı plakadan epire edin ve 10 mililitre soğuk CDM3 ekleyin. Ortamı değiştirdikten sonra, plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde dakikada 70 dönüşte bir yörüngesel çalkalayıcıya geri yerleştirin.
Ortamın renginde belirtildiği gibi büyüme hızına bağlı olarak ortamı her üç ila beş günde bir değiştirin. 70. günde CDM4'ü hazırlayın. Organoidlerin istenilen yaşına gelene kadar CDM4 ortamını kullanın.
Bu süre zarfında, plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde dakikada 70 dönüşte ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcıda tutun. Büyüme hızına bağlı olarak ortamı her üç ila beş günde bir değiştirin. %4 PFA çözeltisi hazırlayın ve bir emniyet başlığının altına yerleştirin.
Beyin organoidlerini toplayın ve künt uçlu üç mililitre plastik Pasteur pipetle pfa ile dolu altı kuyulu bir tabağa hafifçe aktarın. Organoidleri oda sıcaklığında bir saat PFA çözeltisinde tutun. PFA'yı üç mililitre plastik Pasteur pipetle dikkatlice çıkarın ve sabit organoidleri PBS kullanarak üç kez yıkayın.
Sabit organoidleri bir sonraki kullanıma kadar PBS'de dört santigrat derecede saklayın. Bu protokol kullanılarak oluşturulan organoidler, aksonlara ve dendritlere özgü protein belirteçleri kullanılarak görselleştirilebilen olgun nöronlar içerir. Olgun organoidler sadece nöronal hücreler değil, aynı zamanda glial hücreler de içerir.
Dilimlenmiş beyin organoidleri analizini kullanarak, SMI 312 pozitif aksonları ve MAP2 pozitif dendritleri veya S100 beta glial hücreleri izlemek mümkündür. Ayrıca, konfokal görüntüler BETA-3 tübulin pozitif nöronlara göre SOX2 pozitif nöral progenitörlerin ayrıntılı dağılımını ve organizasyonunu araştırmaya yardımcı olmaya yardımcıdır. Beyin organoidleri, dış zarın translokaz veya TOM20 gibi mitokondrilere özgü belirteçler için lekelendi.
Beyin organoidlerinin biyoenergetik profilleme işlemi, hem oksijen tüketim oranı veya OCR kullanılarak mitokondriyal metabolizmalar hem de hücre dışı asitleşme oranı veya ECAR kullanılarak glikolitik metabolizma ölçülerek gerçekleştirildi. Oligomycin, OCR profilinde bir düşüşe neden olur ve bu nedenle ATP üretimi için gereken OCR'yi tanımlar. Oligomycin tedavisinde, ECAR'da hücrelerin metabolik stresi önlemek için glikolizi yükseltebileceğini düşündüren telafi edici bir artış da olabilir.
Nörosferleri 96 kuyu plakasından bir kültür plakasına aktarırken veya sabitleme prosedürü sırasında, organoidlerin zarar vermemesi için nazikçe ele alınması çok önemlidir. Beyin organoidlerinin üretilmesini takiben, çoklu elektrot dizisi veya kalsiyum görüntüleme organoidlerin işlevselliğini test etmek için ideal yöntemler olacaktır.
