이 방법을 통해 연구자들은 매트릭스 단서가 3D 배양에서 세포의 표현형에 어떻게 영향을 미치는지 체계적으로 조사 할 수 있습니다. GBM 세포의 배양물을 이용한 절차를 입증한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 많은 매트릭스 조건을 스크리닝 할 수있는 높은 처리량 구현입니다.
이 기술은 종양 세포의 약물 내성과 같은 세포 배양 모델에서 특정 기능을 보존하고 잠재적으로 새로운 치료제를 식별하는 조직 모방 매트릭스를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Seidlits Lab의 학부 연구원 인 Mary Epperson과 Kelly Tamura입니다. 행크스 균형 잡힌 소금 용액에 HEPES 분말을 20 밀리몰로 용해시켜 HEPES 완충 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.
완전 흡착 후 pH를 일곱 개로 조정하십시오. HEPES 완충 용액에서, 티올화된 HA를 용해시켜 각 글루쿠론산 상의 6 내지 8%의 카르복실산 잔기가 완충 용액 중에 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 티올로 개질되도록 한다. 완전히 용해될 때까지, 전형적으로 약 45분 동안 실온에서 자석 교반 플레이트를 사용하여 분당 1, 000회 회전으로 교반한다.
HA가 용해되는 동안, 마이크로원심분리 튜브에서 8arm PEG 노르보르넨의 밀리리터당 100밀리그램, 4arm PEG 티올의 밀리리터당 100밀리그램, 시스테인 또는 시스테인 함유 펩티드의 4밀리몰, 및 LAP의 밀리리터당 4밀리그램의 분리된 용액을 준비한다. 이 시점에서 단일 하이드로겔 내에 테더링될 모든 펩티드의 네 밀리몰 용액을 준비한다. HA, PEG 노보넨, PEG 티올, 및 시스테인-티올-함유 펩티드의 개별 용액을 혼합하여 최종 히드로겔 매트릭스에 대한 최종 농도를 달성한다.
자기 계단 플레이트에서 분당 1, 000회 미만으로 30분 이상 저어주어 완전히 혼합합니다. 샘플을 실리콘 몰드 또는 384웰 플레이트의 단일 컬럼에 있는 다른 모든 LED와 조명 장치와 정렬합니다. UV LED 매개 변수를 열고 강도 및 조명 값을 입력하십시오.
그런 다음 마침을 클릭하여 조명을 시작하십시오. 조명에 이어 한쪽 모서리에 놓으면 웰 플레이트를 다음 모서리로 이동하고 반복하십시오. 플레이트의 나머지 절반에 있는 웰을 비추려면 플레이트를 홀더에서 들어올려 180도 회전시킵니다.
다양한 역학을 가진 하이드로젤을 생성하려면 테이프를 사용하여 유리 슬라이드와 실리콘 몰드를 청소하여 이물질을 제거하십시오. 실리콘 몰드를 유리 슬라이드에 부착하고 아래로 눌러 좋은 씰을 보장하고 기포를 대체하십시오. 다음으로, 80 마이크로리터의 하이드로겔 전구체 용액을 유리 슬라이드 상의 각 실리콘 몰드에 피펫팅한다.
유리 슬라이드를 단일 열의 다른 모든 LED와 정렬된 조명 장치 위에 놓습니다. 하이드로겔 전구체를 15초 동안 자외선에 노출시켜 포토 가교결합시킨다. 조명이 멈 추면 슬라이드를 검색하고 미세한 팁으로 금형의 내부 둘레를 추적하여 금형에서 젤을 느슨하게하십시오.
핀셋이나 포셉으로 실리콘 몰드를 제거하십시오. 12웰 플레이트에 2밀리리터의 DPBS를 채웁니다. 가교 된 하이드로 젤을 주걱을 적시고 유리 슬라이드에서 부드럽게 밀어 넣어 개별 웰 플레이트로 옮깁니다.
원하는 세포를 단일 세포 용액으로 준비하십시오. 직경 약 150 마이크로미터의 교모세포종 구상체를 T-75 플라스크 현탁액 배양물에서 15밀리리터 원뿔형 튜브로 수집합니다. 배양 플라스크를 다섯 밀리리터의 DPBS로 헹구어 잔류 세포 및 배지를 제거하고 이 부피를 원뿔형 튜브에 첨가한다.
세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리한다. 원심분리 후, 상층액을 다섯 밀리리터 혈청학적 피펫으로 제거하고, 세포 펠릿을 교란시키지 않도록 주의하고, 다섯 밀리리터의 DPBS에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리하여 세포를 세척한다.
상층액을 다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의 한 다음 세포를 두 밀리리터의 세포 해리 시약으로 재현탁하십시오. 실온에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 세 밀리리터의 완전한 배지를 넣고 부드럽게 피펫을 세 번에서 다섯 번 넣어 구상체를 단일 세포 현탁액으로 분해합니다.
단일 세포 현탁액을 실온에서 세포를 펠릿화하기 위해 5분 동안 400배 G에서 원심분리한다. 상층액을 다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 흡인하여 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 세포를 한 밀리리터의 완전한 배지에 재현탁하십시오.
혈구측정기를 사용하여 계수하기 위해 세포의 일부를 제거하십시오. 이 부분을 트립판 블루로 두 배로 희석하여 생존력이 손상된 세포에 침투시킵니다. 살아있는 무색 세포 만 계산하십시오.
캡슐화에 필요한 셀 수를 결정합니다. 필요한 총 세포 수를 포함하는 배지의 부피를 멸균 1.7밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 옮긴다. 실온에서 5분 동안 400배 G에서 회전합니다.
상층액을 마이크로 피펫으로 흡인하고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오. 세포 펠릿을 하이드로겔 전구체 용액에 재현탁시키고, 1, 000 마이크로리터 마이크로피펫으로 네 번 내지 다섯 번 위아래로 피펫팅함으로써 잘 혼합한다. 세포를 10 마이크로리터를 분배하도록 설정된 반복 피미터에 로드하십시오.
거품과 고르지 않은 분배를 피하려면 폐기물 용기에 한 두 번 추가로 분배하여 반복 배관기를 프라이밍하십시오. 384-웰 플레이트의 각 웰에서, 하이드로겔 용액에 현탁된 10 마이크로리터의 세포를 반복 피펫터로부터 분배한다. LED 어레이를 사용하여 셀이 포함된 각 웰을 15초 동안 비추어 원하는 기계적 특성을 달성합니다.
세포를 포함하는 각 웰에 40 마이크로리터의 완전한 배지를 첨가한다. 50 마이크로리터의 DPBS를 겔을 둘러싸고 있는 비실험적 건조 웰에 첨가하여 증발로 인한 손실을 최소화합니다. 교모세포종 세포의 경우, 캡슐화 후 사흘 후에 시작하여 최종 원하는 농도를 달성하기 위해 배지 함유 약물 40 마이크로리터를 첨가하십시오.
10 마이크로리터의 CCK8 시약을 세포가 들어있는 각 웰에 첨가한다. 제조업체의 지침에 따라 한 시간에서 네 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 모든 웰에 대해 450 나노미터에서 흡광도를 판독하십시오.
단일 하이드로젤의 표면에서 미크론 스케일 영역에 대한 AFM 심문은 더 부드러운 평균 영 모듈리를 갖는 하이드로젤이 또한 더 뻣뻣한 하이드로젤보다 더 작은 모듈리 범위를 갖는다는 것을 보여주었다. 밀리리터 당 2, 500, 000 세포의 밀도로 시딩된 GS122 세포의 3D 배양물은 밀리리터 당 500, 000 세포의 밀도로 시딩된 것과 비교하여 배양에서 7일 후에 평가되었을 때 실질적으로 더 높은 생존력을 나타내었다. GS122 세포는 오스테오폰틴 유래 펩타이드가 매트릭스에 포함되었을 때 8킬로파스칼 조건에서 생존 이득을 보인 반면, 인테그린 결합 시알로단백질 또는 테나신 C 유래 펩타이드의 혼입은 생강 RGD 펩타이드와 배양 및 매트릭스와 같은 최소한의 생존 이점을 제공했다.
대조적으로, 어떠한 펩티드도 0.8 킬로파스칼 배양 조건에서 생존 이득을 부여하지 않았다. GS122 및 GS304 세포 둘 다 RGD 함유 펩티드를 포함하는 연질 또는 뻣뻣한 하이드로겔 매트릭스에서 배양될 때 확산된다. GS122 세포는 오스테오폰틴과 함께 0.8 및 8 킬로파스칼 모두에서 확산의 유사한 결핍을 보여준다.
그러나, GS122는 단지 8킬로파스칼 조건에서 테모졸로마이드에 대한 향상된 내성을 나타냈다. 마지막으로, 이 소형화된 3D 배양 플랫폼은 말기 분화된 신경내분비 전립선암 세포의 실행 가능한 오가노이드를 포함하는 다른 종양 유형으로부터 인간 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 이 절차에 따라, 단세포 RNA 시퀀싱과 같은 추가 기술을 사용하여 세포 표현형을 추가로 특성화할 수 있다.
