שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור באופן שיטתי כיצד רמזי מטריצה משפיעים על הפנוטיפ של תאים בתרבית תלת-ממדית. אנו מדגימים את ההליך באמצעות תרביות של תאי GBM. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יישום תפוקה גבוהה, המאפשר לנו לסנן תנאי מטריצה רבים.
טכניקה זו יכולה לשמש לפיתוח מטריצות חיקוי רקמות המשמרות תפקודים ספציפיים במודלים של תרביות תאים, כמו עמידות לתרופות של תאי הגידול, וייתכן שהן מזהות טיפולים חדשים. המדגימות את ההליך יהיו מרי אפרסון וקלי טמורה, חוקרות לתואר ראשון ממעבדת Seidlits. התחילו בהכנת תמיסה עם חציצה HEPES על ידי המסת אבקת HEPES ב-20 מילימולאר בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס.
התאימו את ה-pH לשבעה לאחר התפשטות מלאה. בתמיסה המכילה חציצה HEPES, ממיסים את ה-HA התיולטיבי כך ש-6%עד 8% משאריות החומצה הקרבוקסילית על כל חומצה גלוקורונית משתנות עם תיול בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר בתמיסת חיץ. יש לערבב בפחות מ-1, 000 סיבובים לדקה באמצעות לוח ערבוב מגנטי בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה, בדרך כלל כ-45 דקות.
בזמן ש-HA מתמוסס, הכינו תמיסות נפרדות של 100 מיליגרם למיליליטר של 8 גרם PEG norbornene, 100 מיליגרם למיליליטר של תיול PEG 4arm, ארבעה מילימולר של ציסטאין או פפטיד המכיל ציסטאין, וארבעה מיליגרם למיליליטר של LAP בצינורות מיקרוצנטריפוגה. הכן תמיסות של ארבעה מילימולרים של כל הפפטידים כדי להיות קשור בתוך הידרוג'ל יחיד בשלב זה. ערבבו את התמיסות הבודדות של פפטידים המכילים HA, PEG norbornene, PEG thiol ו-cysteine-thiol כדי להשיג את הריכוזים הסופיים עבור מטריצות ההידרוג'ל הסופיות.
יש לערבב בפחות מ-1, 000 סיבובים בדקה על לוח מדרגות מגנטי למשך 30 דקות לפחות כדי לערבב באופן מלא. יישר את הדגימות עם התקן התאורה עם כל נורית LED אחרת בעמודה אחת של תבניות הסיליקון או צלחת 384 הבאר. פתח פרמטרים של UV LED והזן ערכים לעוצמה ותאורה.
לאחר מכן לחץ על סיום כדי להתחיל בתאורה. לאחר התאורה, כאשר היא ממוקמת בפינה אחת, הזיזו את צלחת הבאר לפינה הבאה וחזרו על הפעולה. כדי להאיר בארות בחצי השני של הצלחת, הרימו את הצלחת מהמחזיק וסובבו 180 מעלות.
כדי ליצור הידרוג'לים עם מכניקה משתנה, התחילו בניקוי מגלשות הזכוכית ותבניות הסיליקון באמצעות סרט הדבקה להסרת פסולת. הדביקו את תבניות הסיליקון למגלשת הזכוכית, לחצו למטה כדי להבטיח אטימה טובה והזיזו את בועות האוויר. לאחר מכן, פיפטה 80 microliters של תמיסת הידרוג'ל מבשר לתוך כל תבנית סיליקון על מגלשת הזכוכית.
מקם את שקופית הזכוכית על התקן התאורה מיושר עם כל נורית LED אחרת בעמודה אחת. חשוף את מבשרי ההידרוג'ל לאור UV למשך 15 שניות כדי לצלם קישור צולב. לאחר הפסקת התאורה, שלפו את המגלשות ושחררו את הג'לים מהתבניות על ידי התחקות אחר ההיקף הפנימי של התבנית עם קצה דק.
הסר תבניות סיליקון עם פינצטה או מלקחיים. מלאו צלחת של 12 בארות בשני מיליליטרים של DPBS. הזז הידרוג'לים מקושרים לתוך צלחת באר בודדת על ידי הרטבת מרית ודחיפה עדינה שלהם ממגלשת הזכוכית.
הכן את התאים הרצויים כתמיסה חד-תאית. אספו כדוריות גליובלסטומה, בקוטר של כ-150 מיקרומטרים, מתרבית תרחיף של צלוחית T-75 לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. יש לשטוף את בקבוקון התרבית בחמישה מיליליטרים של DPBS כדי להסיר את שאריות התאים והמדיה ולהוסיף נפח זה לצינור החרוטי.
צנטריפוגה הצינור החרוטי המכיל תאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, תוך הקפדה שלא להפריע לכדור התא ולהחייאתו בחמישה מיליליטרים של DPBS. צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לשטוף תאים.
לשאוף את הסופרנטנט עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטרים, תוך הקפדה שלא להפריע לכדור התא, ולאחר מכן להחיות תאים בשני מיליליטרים של מגיב דיסוציאציה של תאים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. הוסיפו שלושה מיליליטרים של מדיום שלם ובעדינות פיפטה שלוש עד חמש פעמים כדי לפרק את הספרואידים לתרחיף חד-תאי.
צנטריפוגה של ההשעיה החד-תאית ב-400 פעמים G במשך חמש דקות כדי לכדור תאים בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא. תאי החייאה במיליליטר אחד של מדיום שלם.
הסר חלק מהתאים לספירה באמצעות המוציטומטר. דיללו את החלק הזה פי שניים בכחול טריפאן, המחלחל לתאים עם יכולת קיום נפגעת. ספרו רק את התאים החיים וחסרי הצבע.
קבע את מספר התאים הדרושים לאנקפסולציה. העבר נפח של מדיה המכילה את המספר הכולל של התאים הדרושים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.7 מיליליטר. סובבו כלפי מטה ב-400 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לשאוף את supernatant עם micropipette, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא. בצעו החייאה של גלולת התא בתמיסת מבשר ההידרוג'ל, תוך ערבוב טוב על ידי צנרת למעלה ולמטה עם מיקרופיפטה של 1, 000 מיקרוליטר ארבע עד חמש פעמים. טען את התאים לתוך ערכת צינורות חוזרת כדי לחלק 10 מיקרוליטרים.
כדי למנוע בועות וחלוקה לא אחידה, הכינו את הצינור החוזר על ידי חלוקה של פעם או פעמיים נוספות למיכל פסולת. בכל באר של צלחת של 384 קידוחים, מחלקים 10 מיקרוליטרים של תאים התלויים בתמיסת הידרוג'ל מהפייטר החוזר. באמצעות מערך ה-LED, האירו כל תא המכיל באר למשך 15 שניות כדי להשיג את התכונות המכניות הרצויות.
הוסיפו 40 מיקרוליטרים של מדיה מלאה לכל באר המכילה את התאים. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של DPBS לבארות יבשות שאינן ניסיוניות המקיפות את הג'לים כדי למזער הפסדים עקב אידוי. עבור תאי גליובלסטומה, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של התרופה המכילה מדיה כדי להשיג את הריכוז הרצוי הסופי, החל משלושה ימים לאחר האנקפסולציה.
הוסף 10 מיקרוליטרים של ריאגנט CCK8 לכל באר המכילה את התאים. דגירה למשך שעה עד ארבע שעות, על פי הוראות היצרן. קרא את הספיגה ב-450 ננומטר לכל הבארות לאחר הדגירה.
חקירת AFM של אזורים בקנה מידה של מיקרון על פני השטח של הידרוג'לים בודדים הראתה כי להידרוג'לים עם מודולי יאנג ממוצע רך יותר היו גם טווחים קטנים יותר של מודולי מאשר הידרוג'לים נוקשים יותר. תרביות תלת-ממדיות של תאי GS122 שנזרעו בצפיפות של 2, 500, 000 תאים למיליליטר הפגינו יכולת גבוהה משמעותית כאשר הוערכו לאחר שבעה ימים בתרבית בהשוואה לאלה שנזרעו בצפיפות של 500, 000 תאים למיליליטר. תאי GS122 הראו עליות הישרדות במצב של שמונה קילופסקל כאשר פפטידים שמקורם באוסטאופונטין נכללו במטריצה, בעוד ששילובם של פפטידי סיאלופרוטאין קושרי אינטגרין או פפטידים שמקורם בטנסין C סיפק יתרונות הישרדותיים מינימליים, כגון תרבית ומטריצות עם פפטיד RGD ג'ינג'ר.
לעומת זאת, אף פפטיד לא העניק רווחי הישרדות במצב תרבית של 0.8 קילופסקל. גם תאי GS122 וגם תאי GS304 מתפשטים כאשר הם מתרבים במטריצות הידרוג'ל רכות או נוקשות, כולל פפטידים המכילים RGD. תאי GS122 מראים חוסר התפשטות דומה גם ב-0.8 וגם ב-8 קילופסקלים עם אוסטאופונטין.
עם זאת, GS122 הראה רק עמידות מוגברת לטמוזולומיד במצב של שמונה קילופסקלים. לבסוף, פלטפורמת תרבית תלת-ממדית ממוזערת זו יכולה לשמש לתרבית תאים אנושיים מסוגי גידולים אחרים, כולל אורגנואידים בני קיימא של תאי סרטן ערמונית נוירואנדוקריניים ממוינים סופניים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות נוספות כגון ריצוף RNA חד-תאי כדי לאפיין עוד יותר את הפנוטיפים של התא.
