Este método permite que os pesquisadores testem sistematicamente como as pistas matriciais afetam o fenótipo das células na cultura 3D. Demonstramos o procedimento usando culturas de células GBM. A principal vantagem dessa técnica é a implementação de alto rendimento, o que nos permite telar muitas condições matriciais.
Esta técnica pode ser usada para desenvolver matrizes mímicas teciduais que preservam funções específicas em modelos de cultura celular, como a resistência a medicamentos de células tumorais, e potencialmente identificam novas terapêuticas. Demonstrando o procedimento estarão Mary Epperson e Kelly Tamura, pesquisadores de graduação do Seidlits Lab. Comece com a preparação de solução tamponada pelo HEPES, dissolvendo o pó HEPES em 20 mililitros na solução de sal balanceado Hanks.
Ajuste o pH para sete após a sorbação total. Na solução tamponada hepes, dissolva ha tialvidado de modo que 6 a 8% dos resíduos de ácido carboxílico em cada ácido glucurônico sejam modificados com um tiol a uma concentração de 10 miligramas por mililitro na solução tampão. Mexa a menos de 1.000 rotações por minuto usando uma placa de agitação magnética à temperatura ambiente até dissolver totalmente, normalmente em torno de 45 minutos.
Enquanto a HA está dissolvendo, prepare soluções separadas de 100 miligramas por mililitro de 8arm PEG norbornene, 100 miligramas por mililitro de thiol PEG de 4arm, quatro milimolar de cisteína ou peptídeo contendo cisteína, e quatro miligramas por mililitro de LAP em tubos de microcentrífuga. Prepare soluções de quatro milimões de todos os peptídeos para serem amarrados dentro de um único hidrogel neste momento. Misture as soluções individuais de HA, PEG norbornene, PEG thiol e peptídeos contendo cysteine-thiol para alcançar as concentrações finais para as matrizes finais de hidrogel.
Mexa a menos de 1.000 rotações por minuto em uma placa de escada magnética por pelo menos 30 minutos para misturar completamente. Alinhe as amostras com o dispositivo de iluminação com todos os outros LED em uma única coluna dos moldes de silicone ou placa de 384 poços. Abra parâmetros de LED UV e digite valores para intensidade e iluminação.
Em seguida, clique em Concluir para iniciar a iluminação. Seguindo a iluminação, quando colocado em um canto, mova a placa do poço para a próxima curva e repita. Para iluminar poços na outra metade da placa, levante a placa para fora do suporte e gire 180 graus.
Para gerar hidrogéis com mecânicas variadas, comece com a limpeza dos lâminas de vidro e moldes de silicone usando fita adesiva para remover detritos. Adere aos moldes de silicone ao deslizamento de vidro, pressione para baixo para garantir uma boa vedação e desloque quaisquer bolhas de ar. Em seguida, pipeta 80 microliters de solução precursora de hidrogel em cada molde de silicone na lâmina de vidro.
Coloque o deslizamento de vidro sobre o dispositivo de iluminação alinhado com todos os outros LED em uma única coluna. Exponha os precursores do hidrogel à luz UV por 15 segundos para o link de fotos. Uma vez que a iluminação tenha parado, recupere os slides e solte os géis dos moldes, traçando a circunferência interna do molde com uma ponta fina.
Remova os moldes de silicone com pinças ou fórceps. Encha uma placa de 12 poços com dois mililitros de DPBS. Mova hidrogéis transversais para a placa de poço individual, molhando uma espátula e empurrando-os suavemente para fora do escorregador de vidro.
Prepare células desejadas como uma solução unicelular. Colete glioblastoma spheroids, aproximadamente 150 micrômetros de diâmetro, de uma cultura de suspensão de frasco T-75 em um tubo cônico de 15 mililitros. Enxágüe o frasco de cultura com cinco mililitros de DPBS para remover quaisquer células residuais e mídia e adicionar este volume ao tubo cônico.
Centrifugar o tubo cônico contendo células a 200 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova o supernascedor com uma pipeta serológica de cinco mililitros, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular e resuspend em cinco mililitros de DPBS. Centrifugar a 200 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente para lavar células.
Aspire o supernante com uma pipeta sorológica de cinco mililitros, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e então resuspend células em dois mililitros de reagente de dissociação celular. Incubar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Adicione três mililitros de pipeta média e suavemente completa três a cinco vezes para quebrar os esferoides a uma suspensão de célula única.
Centrifugar a suspensão unicelular a 400 vezes G durante cinco minutos para as células de pelotas à temperatura ambiente. Aspire o supernatante com uma pipeta sorológica de cinco mililitros, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Resuspend células em um mililitro de meio completo.
Remova uma parte das células para contar usando um hemótmetro. Diluir essa porção dupla com o azul trypan, que permeia as células com viabilidade comprometida. Conte apenas as células vivas e incolores.
Determine o número de células necessárias para encapsulamento. Transfira um volume de mídia contendo o número total de células necessárias para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro estéril. Gire a 400 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente.
Aspire o supernatante com uma micropipette, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular. Resuspenque a pelota celular na solução precursora do hidrogel, misturando-se bem por tubulação para cima e para baixo com uma micropipette de 1.000 microliter quatro a cinco vezes. Carregue as células em um conjunto de tubulação repetida para distribuir 10 microliters.
Para evitar bolhas e dispensação irregular, prime a pipetter repetição, distribuindo um adicional de uma a duas vezes em um recipiente de lixo. Em cada poço de uma placa de 384 poços, dispense 10 microliters de células suspensas em solução de hidrogel da tubulação repetida. Usando o array LED, ilumine cada célula contendo poços por 15 segundos para alcançar as propriedades mecânicas desejadas.
Adicione 40 microliters de mídia completa a cada poço contendo as células. Adicione 50 microliters de DPBS a poços secos não experimentais ao redor dos géis para minimizar as perdas devido à evaporação. Para células de glioblastoma, adicione 40 microliters da droga que contém mídia para alcançar a concentração final desejada, começando três dias após o encapsulamento.
Adicione 10 microlitres de reagente CCK8 a cada poço contendo as células. Incubar por uma a quatro horas, de acordo com as instruções do fabricante. Leia absorventes a 450 nanômetros para todos os poços após a incubação.
O interrogatório da AFM sobre regiões em escala de micron nas superfícies de hidrogéis únicos mostrou que hidrogéis com moduli médio mais suave de Young também tinham faixas menores de moduli do que hidrogéis mais rígidos. Culturas 3D de células GS122 semeadas em densidades de 2.500.000 células por mililitro apresentaram viabilidades substancialmente maiores quando avaliadas após sete dias de cultura em comparação com aquelas semeadas em densidades de 500.000 células por mililitro. As células GS122 apresentaram ganhos de sobrevivência na condição de oito quilopascal quando peptídeos derivados da osteopontina foram incluídos na matriz, enquanto a incorporação de sialoproteína integrin ou peptídeos derivados de tenascina C proporcionou benefícios mínimos de sobrevivência, como cultura e matrizes com o peptídeo RGD gengibre.
Em contraste, nenhum peptídeo conferiu ganhos de sobrevivência na condição de cultura quilopascal de 0,8 quilocal. Ambas as células GS122 e GS304 se espalham quando cultivadas em matrizes de hidrogel macias ou rígidas, incluindo peptídeos contendo RGD. As células GS122 apresentam uma falta semelhante de propagação em 0,8 e 8 quilopascals com osteopontina.
No entanto, o GS122 só apresentou maior resistência à temozolomida na condição de oito quilopascals. Finalmente, esta plataforma de cultura 3D miniaturizada pode ser usada para cultivar células humanas de outros tipos de tumores, incluindo organoides viáveis de células cancerígenas neuroendócrinas terminalmente diferenciadas. Após este procedimento, outras técnicas como o sequenciamento de RNA unicelular podem ser usadas para caracterizar ainda mais fenótipos celulares.
