Questo metodo consente ai ricercatori di sondare sistematicamente come i segnali della matrice influenzano il fenotipo delle cellule in coltura 3D. Dimostriamo la procedura utilizzando colture di cellule GBM. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'implementazione ad alto throughput, che ci consente di esaminare molte condizioni della matrice.
Questa tecnica può essere utilizzata per sviluppare matrici tessuto-mimetiche che preservano funzioni specifiche in modelli di coltura cellulare, come la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali, e potenzialmente identificare nuove terapie. A dimostrare la procedura saranno Mary Epperson e Kelly Tamura, ricercatori universitari del Seidlits Lab. Iniziate con la preparazione della soluzione tamponata HEPES sciogliendo la polvere hepes a 20 millimolari in soluzione salina bilanciata Hanks.
Regolare il pH a sette dopo l'assorbimento completo. Nella soluzione tamponata con HEPES, sciogliere l'HA tiolato in modo che dal 6 all'8% dei residui di acido carbossilico su ciascun acido glucuronico siano modificati con un tiolo ad una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro in soluzione tampone. Mescolare a meno di 1.000 rotazioni al minuto utilizzando una piastra magnetica a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione, in genere circa 45 minuti.
Mentre l'HA si sta dissolvendo, preparare soluzioni separate di 100 milligrammi per millilitro di 8arm PEG norbornene, 100 milligrammi per millilitro di 4arm PEG tiolo, quattro millimolari di cisteina o peptide contenente cisteina e quattro milligrammi per millilitro di LAP in tubi microcentrifuga. Preparare soluzioni a quattro millimolari di tutti i peptidi da legare all'interno di un singolo idrogel a questo punto. Mescolare le singole soluzioni di HA, PEG norbornene, PEG tiolo e peptidi contenenti cisteina-tiolo per ottenere le concentrazioni finali per le matrici di idrogel finali.
Mescolare a meno di 1.000 rotazioni al minuto su una piastra magnetica per almeno 30 minuti per mescolare completamente. Allineare i campioni con il dispositivo di illuminazione con ogni altro LED in una singola colonna degli stampi in silicone o piastra a 384 pozzetti. Aprire i parametri LED UV e immettere i valori per l'intensità e l'illuminazione.
Quindi fare clic su Fine per iniziare l'illuminazione. Dopo l'illuminazione, quando viene posizionato in un angolo, spostare la piastra del pozzo nell'angolo successivo e ripetere. Per illuminare i pozzetti sull'altra metà della piastra, sollevare la piastra dal supporto e ruotare di 180 gradi.
Per generare idrogel con meccanica variabile, iniziare con la pulizia delle diapositive di vetro e degli stampi in silicone usando del nastro adesivo per rimuovere i detriti. Aderire gli stampi in silicone alla slitta di vetro, premere verso il basso per garantire una buona tenuta e spostare eventuali bolle d'aria. Successivamente, pipettare 80 microlitri di soluzione precursore dell'idrogel in ogni stampo in silicone sul vetrino.
Posizionare la slitta di vetro sul dispositivo di illuminazione allineato con ogni altro LED in una singola colonna. Esporre i precursori dell'idrogel alla luce UV per 15 secondi al collegamento incrociato fotografico. Una volta che l'illuminazione si è fermata, recuperare le diapositive e allentare i gel dagli stampi tracciando la circonferenza interna dello stampo con una punta fine.
Rimuovere gli stampi in silicone con pinzette o pinze. Riempire una piastra a 12 pozzetti con due millilitri di DPBS. Spostare gli idrogel reticolati nella singola piastra del pozzo bagnando una spatola e spingendoli delicatamente fuori dal vetrino.
Preparare le cellule desiderate come soluzione a cella singola. Raccogliere gli sferoidi del glioblastoma, circa 150 micrometri di diametro, da una coltura di sospensione del pallone T-75 in un tubo conico da 15 millilitri. Risciacquare il matraccio di coltura con cinque millilitri di DPBS per rimuovere eventuali cellule e mezzi residui e aggiungere questo volume al tubo conico.
Centrifugare il tubo conico contenente le celle a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica da cinque millilitri, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare e risospenderlo in cinque millilitri di DPBS. Centrifugare a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente per lavare le celle.
Aspirare il surnatante con una pipetta sierologica da cinque millilitri, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare, e quindi risospese le cellule in due millilitri di reagente di dissociazione cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Aggiungere tre millilitri di mezzo completo e pipettare delicatamente da tre a cinque volte per abbattere gli sferoidi in una sospensione a cella singola.
Centrifugare la sospensione monocellulare a 400 volte G per cinque minuti in celle a pellet a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante con una pipetta sierologica da cinque millilitri, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Sostituire le celle in un millilitro di mezzo completo.
Rimuovere una parte delle cellule per il conteggio utilizzando un emocitometro. Diluire questa porzione due volte con tripano blu, che permea le cellule con vitalità compromessa. Conta solo le cellule vive e incolori.
Determinare il numero di celle necessarie per l'incapsulamento. Trasferire un volume di fluido contenente il numero totale di cellule necessarie in un tubo microcentrifuga sterile da 1,7 millilitri. Girare verso il basso a 400 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il surnatante con una micropipetta, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Risospesso il pellet cellulare nella soluzione precursore dell'idrogel, mescolando bene pipettando su e giù con una micropipetta da 1.000 microlitri da quattro a cinque volte. Caricare le celle in un set di pipetter ripetuti per erogare 10 microlitri.
Per evitare bolle e un'erogazione irregolare, innescare il pipetter ripetuto erogando un ulteriore una o due volte in un contenitore per i rifiuti. In ogni pozzetto di una piastra da 384 pozzetti, erogare 10 microlitri di celle sospese in soluzione di idrogel dal pipetter ripetuto. Utilizzando l'array di LED, illuminare ogni cella contenente il pozzo per 15 secondi per ottenere le proprietà meccaniche desiderate.
Aggiungere 40 microlitri di supporti completi a ciascun pozzo contenente le celle. Aggiungere 50 microlitri di DPBS a pozzi asciutti non sperimentali che circondano i gel per ridurre al minimo le perdite dovute all'evaporazione. Per le cellule di glioblastoma, aggiungere 40 microlitri del farmaco contenente i mezzi per raggiungere la concentrazione finale desiderata, a partire da tre giorni dopo l'incapsulamento.
Aggiungere 10 microlitri di reagente CCK8 a ciascun pozzetto contenente le cellule. Incubare da una a quattro ore, secondo le istruzioni del produttore. Leggere le assorbanze a 450 nanometri per tutti i pozzi successivi all'incubazione.
L'interrogazione AFM di regioni su scala micron sulle superfici di singoli idrogel ha mostrato che gli idrogel con moduli di Young medi più morbidi avevano anche intervalli di moduli più piccoli rispetto agli idrogel più rigidi. Le colture 3D di cellule GS122 seminate a densità di 2.500.000 cellule per millilitro hanno mostrato viabilità sostanzialmente più elevate se valutate dopo sette giorni in coltura rispetto a quelle seminate a densità di 500.000 cellule per millilitro. Le cellule GS122 hanno mostrato guadagni di sopravvivenza nella condizione di otto kilopascali quando i peptidi derivati dall'osteopontina sono stati inclusi nella matrice, mentre l'incorporazione di sialoproteine leganti l'integrina o peptidi derivati dalla tenascina C ha fornito benefici minimi di sopravvivenza, come la coltura e le matrici con il peptide RGD dello zenzero.
Al contrario, nessun peptide ha conferito guadagni di sopravvivenza nella condizione di coltura di 0,8 kilopascal. Entrambe le cellule GS122 e GS304 si diffondono quando coltivate in matrici di idrogel morbide o rigide, compresi i peptidi contenenti RGD. Le cellule GS122 mostrano una simile mancanza di diffusione in entrambi i kilopascal 0,8 e 8 con osteopontina.
Tuttavia, GS122 ha mostrato una maggiore resistenza alla temozolomide solo nella condizione di otto kilopascal. Infine, questa piattaforma di coltura 3D miniaturizzata può essere utilizzata per coltivare cellule umane di altri tipi di tumore, inclusi organoidi vitali di cellule tumorali della prostata neuroendocrine differenziate terminalmente. Seguendo questa procedura, ulteriori tecniche come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula possono essere utilizzate per caratterizzare ulteriormente i fenotipi cellulari.
