Mit dieser Methode können Forscher systematisch untersuchen, wie sich Matrixhinweise auf den Phänotyp von Zellen in 3D-Kultur auswirken. Wir demonstrieren das Verfahren anhand von Kulturen von GBM-Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Implementierung mit hohem Durchsatz, die es uns ermöglicht, viele Matrixbedingungen zu überprüfen.
Diese Technik kann verwendet werden, um gewebemimetische Matrizen zu entwickeln, die spezifische Funktionen in Zellkulturmodellen, wie z.B. die Arzneimittelresistenz von Tumorzellen, beibehalten und möglicherweise neue Therapeutika identifizieren. Mary Epperson und Kelly Tamura, Studentinnen des Seidlits Lab, demonstrieren das Verfahren. Beginnen Sie mit der Herstellung von HEPES-gepufferter Lösung, indem Sie HEPES-Pulver bei 20-Millimolar in Hanks ausgewogener Salzlösung auflösen.
Stellen Sie den pH-Wert nach vollständiger Sorption auf sieben ein. In der HEPES-gepufferten Lösung wird thioliertes HA so gelöst, dass 6 bis 8% Carbonsäurereste auf jeder Glucuronsäure mit einem Thiol in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in Pufferlösung modifiziert werden. Mit weniger als 1.000 Umdrehungen pro Minute mit einer magnetischen Rührplatte bei Raumtemperatur umrühren, bis sie sich vollständig aufgelöst hat, typischerweise etwa 45 Minuten.
Während HA auflöst, bereiten Sie separate Lösungen von 100 Milligramm pro Milliliter 8arm PEG Norbornen, 100 Milligramm pro Milliliter 4arm PEG Thiol, vier Millimolar Cystein oder Cystein-haltiges Peptid und vier Milligramm pro Milliliter LAP in Mikrozentrifugenröhrchen vor. Bereiten Sie vier-millimolare Lösungen aller Peptide vor, die an dieser Stelle in einem einzigen Hydrogel angebunden werden sollen. Mischen Sie die einzelnen Lösungen von HA, PEG-Norbornen, PEG-Thiol und Cystein-Thiol-haltigen Peptiden, um die Endkonzentrationen für die endgültigen Hydrogelmatrizen zu erreichen.
Rühren Sie mit weniger als 1.000 Umdrehungen pro Minute auf einer magnetischen Treppenplatte für mindestens 30 Minuten, um sich vollständig zu mischen. Richten Sie die Proben mit dem Beleuchtungsgerät mit jeder anderen LED in einer einzigen Säule der Silikonformen oder der 384-Well-Platte aus. Öffnen Sie die UV-LED-Parameter und geben Sie Werte für Intensität und Beleuchtung ein.
Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um die Beleuchtung zu starten. Wenn Sie nach der Beleuchtung in einer Ecke platziert sind, bewegen Sie die Bohrlochplatte in die nächste Ecke und wiederholen Sie den Vorgang. Um Vertiefungen auf der anderen Hälfte der Platte zu beleuchten, heben Sie die Platte aus der Halterung und drehen Sie sie um 180 Grad.
Um Hydrogele mit unterschiedlicher Mechanik zu erzeugen, beginnen Sie mit der Reinigung der Glasobjektträger und Silikonformen mit Klebeband, um Ablagerungen zu entfernen. Kleben Sie die Silikonformen auf den Glasschieber, drücken Sie sie nach unten, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten, und verdrängen Sie Luftblasen. Als nächstes pipettieren Sie 80 Mikroliter Hydrogel-Vorläuferlösung in jede Silikonform auf dem Glasobjektträger.
Legen Sie den Glasschieber in einer einzigen Spalte auf das Beleuchtungsgerät, das mit jeder anderen LED ausgerichtet ist. Setzen Sie die Hydrogel-Vorläufer 15 Sekunden lang UV-Licht aus, um Fotos zu vernetzen. Sobald die Beleuchtung gestoppt ist, holen Sie die Dias zurück und lösen Sie die Gele aus den Formen, indem Sie den inneren Umfang der Form mit einer feinen Spitze verfolgen.
Entfernen Sie Silikonformen mit einer Pinzette oder Pinzette. Füllen Sie eine 12-Well-Platte mit zwei Millilitern DPBS. Bewegen Sie vernetzte Hydrogele in die einzelne Wellplatte, indem Sie einen Spatel benetzen und vorsichtig vom Glasobjektträger drücken.
Bereiten Sie die gewünschten Zellen als Einzelzelllösung vor. Sammeln Sie Glioblastom-Sphäroide mit einem Durchmesser von etwa 150 Mikrometern aus einer T-75-Kolbensuspensionskultur in ein 15-Milliliter-konisches Rohr. Spülen Sie den Kulturkolben mit fünf Millilitern DPBS ab, um Restzellen und Medien zu entfernen, und fügen Sie dieses Volumen dem konischen Röhrchen hinzu.
Zentrieren Sie das konische Röhrchen, das die Zellen enthält, bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet nicht zu stören und in fünf Millilitern DPBS zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um Zellen zu waschen.
Aspirieren Sie den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette, achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören, und resuspendieren Sie dann die Zellen in zwei Millilitern Zelldissoziationsreagenz. Bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie drei Milliliter vollständiges Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig drei- bis fünfmal, um die Sphäroide zu einer Einzelzellsuspension abzubauen.
Zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 400 mal G für fünf Minuten, um die Zellen bei Raumtemperatur zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette ab und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie Zellen in einem Milliliter vollständigem Medium.
Entfernen Sie einen Teil der Zellen zum Zählen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie diesen Teil zweifach mit Trypanblau, das Zellen mit beeinträchtigter Lebensfähigkeit durchdringt. Zählen Sie nur die lebenden, farblosen Zellen.
Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Verkapselung erforderlich sind. Übertragen Sie ein Medienvolumen mit der Gesamtzahl der benötigten Zellen in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 400 g nach unten drehen.
Saugen Sie den Überstand mit einer Mikropipette ab und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der Hydrogel-Vorläuferlösung und mischen Sie gut, indem Sie vier- bis fünfmal mit einer 1.000-Mikroliter-Mikropipette auf und ab pipettieren. Laden Sie die Zellen in ein wiederholtes Pipetteraggregat, um 10 Mikroliter abzugeben.
Um Blasen und ungleichmäßiges Dosieren zu vermeiden, grundieren Sie den Wiederholungspipetter, indem Sie ein bis zwei Mal zusätzlich in einen Abfallbehälter dosieren. Geben Sie in jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte 10 Mikroliter Zellen ab, die in Hydrogellösung aus dem Wiederholungspipetter suspendiert sind. Beleuchten Sie mit dem LED-Array jede Well-enthaltende Zelle 15 Sekunden lang, um die gewünschten mechanischen Eigenschaften zu erzielen.
Fügen Sie 40 Mikroliter vollständiges Medium zu jeder Vertiefung hinzu, die die Zellen enthält. Fügen Sie 50 Mikroliter DPBS zu nicht-experimentellen Trockenbrunnen hinzu, die die Gele umgeben, um Verluste durch Verdunstung zu minimieren. Für Glioblastomzellen fügen Sie 40 Mikroliter des medienhaltigen Arzneimittels hinzu, um die endgültige gewünschte Konzentration zu erreichen, beginnend drei Tage nach der Verkapselung.
Fügen Sie 10 Mikroliter CCK8-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzu, die die Zellen enthält. Inkubieren Sie für ein bis vier Stunden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lesen Sie die Absorptionsraten bei 450 Nanometern für alle Vertiefungen nach der Inkubation.
AFM-Befragungen von mikrometerskaligen Regionen an den Oberflächen einzelner Hydrogele zeigten, dass Hydrogele mit weicheren durchschnittlichen Young-Moduli auch kleinere Modulbereiche aufwiesen als steifere Hydrogele. 3D-Kulturen von GS122-Zellen, die mit einer Dichte von 2.500.000 Zellen pro Milliliter ausgesät wurden, zeigten nach sieben Tagen in Kultur eine wesentlich höhere Lebensfähigkeit als diejenigen, die mit einer Dichte von 500.000 Zellen pro Milliliter ausgesät wurden. GS122-Zellen zeigten Überlebensgewinne in der Acht-Kilopascal-Bedingung, wenn Osteopontin-abgeleitete Peptide in die Matrix aufgenommen wurden, während der Einbau von integrinbindenden Sialoprotein- oder Tenascin-C-abgeleiteten Peptiden minimale Überlebensvorteile wie Kultur und Matrizen mit dem Ingwer-RGD-Peptid bot.
Im Gegensatz dazu verschafften keine Peptide Überlebensgewinne in der 0,8-Kilopascal-Kulturbedingung. Sowohl GS122- als auch GS304-Zellen breiten sich aus, wenn sie in weichen oder steifen Hydrogelmatrizen, einschließlich RGD-haltiger Peptide, kultiviert werden. GS122-Zellen zeigen einen ähnlichen Mangel an Streuung sowohl bei 0,8 als auch bei 8 Kilopascal mit Osteopontin.
GS122 zeigte jedoch nur im Zustand von acht Kilopascal eine erhöhte Resistenz gegen Temozolomid. Schließlich kann diese miniaturisierte 3D-Kulturplattform verwendet werden, um menschliche Zellen aus anderen Tumorarten zu kultivieren, einschließlich lebensfähiger Organoide von terminaldifferenzierten neuroendokrinen Prostatakrebszellen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Techniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur weiteren Charakterisierung von Zellphänotypen eingesetzt werden.
