Bu protokol, lisans öğrencilerinin yayınlanabilir sonuçlara yol açabilecek otantik araştırmalar yapmaları için basit ve uygulanabilir bir yoldur. En büyük avantajı, öğrencilerin kendi başlarına karar verdikleri sorular üzerinde özgün araştırmalar yapabilmeleridir. Başlamak için, dokuz mililitrelik cam Pasteur pipeti bir Bunsen brülör alevinde dikkatlice bükerek bir çözelti yayıcı yapın ve pipetin açıklığını kapatın.
Daha sonra etanol, Petri plakasına her yayılmadan önce yayıcıyı sterilize eder. Bir mikropipetleyici kullanarak, 100 mikrolitre seyreltmeyi agarın merkezine yerleştirin ve sterilize edilmiş serpme makinesi ile yüzeye yavaşça yayın. Daha sonra Petri kaplarını bir kenara koyun ve çözeltinin kuruyana kadar yüzeye batırılmasına izin verin.
12 saatten daha uzun maruz kalma süreleri için, nematodları eklemeden önce plakalara 50 mikrolitre gece Escherichia coli kültürü ekleyin, oysa 12 saat veya daha kısa akut deneyler için plakalarda E.coli olmasına gerek yoktur. Bir mikropipet kullanarak, nematod plakasına bir mililitre steril su yerleştirin. Daha sonra, nematodları kaldırmak için suyu etrafta dolaştırın, ardından nematodlarla sıvıyı 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne çıkarın.
10 dakika sonra, nematodlar yerçekimi ile yerleştikçe, suyun en az 500 mikrolitresini dikkatlice çıkarın ve atın. Daha sonra nematodları yeniden askıya alın ve kesilmiş sarı bir pipet ucu kullanarak, her bir tedavi plakasına 50 ila 100 mikrolitre asılı solucan çıkarın ve her plakanın en az 10 yetişkin solucanı olmasını sağlayın. Düzgün kalınlıkta bir ped oluşturmak için slaytın yalnızca bir tarafına bir etiket bandı parçası yerleştirerek iki slayt hazırlayın, ardından tezgahın üzerinde aralarında temiz ve kullanılmayan bir slayt yerleştirin.
Bir mikropipetleyici kullanarak slaytın merkezine 10 mikrolitrelik bir damla erimiş agaroz yerleştirin. Daha sonra, damla ile slayda dik olarak üste başka bir temiz slayt yerleştirerek damlayı düzleştirin ve agaroz damlası etiketleme bandının kalınlığını oluşturacak şekilde basınç uygulayın. Daha sonra, iki slaytı ayırmak için sabit basınç uygulayın.
Daha sonra bu slaytı agar tarafı tezgahın üzerinde yukarı kaldıracak şekilde dinlendirin ve kullanmadan önce bir ila iki dakika kurumasını bekleyin. Hazırlanan slaytın nematodlarını agaroz pedi ile eklemek için, solucanları uyuşturacak ve onları harekete geçirecek olan agar pedine bir molar sodyum azid içeren beş mikrolitrelik bir su damlası ekleyin. Daha sonra, tedavi başına 10 nematodda, nematodların aktarılmasından önce ve sonra sterilize edilmesi gereken bir solucan toplama kullanarak damlacığa aktarın.
Ardından, forseps kullanarak bir açıyla yerleştirip yavaşça indirerek bir kapak kayması ekleyin. Daha sonra, solucanları önce 10X büyütme ve faz kontrastı altında, daha sonra faz kontrastı ve floresan aydınlatma ile 40X büyütme altında gözlemlemek için hazırlanan ıslak montajı bir floresan mikroskop üzerine yerleştirin. Mikroskop sahnesine her seferinde bir tane hazırlanmış ıslak montaj yerleştirin ve mikroskop sahne klipslerini kullanarak yerine sabitleyin, ardından ıslak montajları tipik olarak 10X olan en düşük büyütme hedefiyle görüntülemeye başlayın ve nematodları görselleştirmek ve odaklanmak için parlak bir alan veya faz kontrastı kullanın.
Görüş alanına bir nematod yerleştirildikten sonra, mikroskop üzerindeki ince odaklamalı düğmeyi kullanarak üzerine odaklanın, ardından kadranı çevirerek aydınlatmayı floresana çevirin ve dijital görüntüleri yakalamak için ışığı kameraya yönlendirin. Ardından, görüntüleme yazılımını kullanarak aydınlatmayı ayarlayın, böylece nöronlar parlak bir şekilde aydınlatılır, ancak aşırı doymamış olur. Bir noktada, şekilleri için bir büyütme ölçeği sağlamak üzere hücre görüntüleriyle aynı büyütmede bir cetvelin ayrı bir görüntüsünü elde edin.
Pestisit içeren manganezin dopamin nöron morfolojisi üzerindeki etkileri, dopamin nöronlarının GFP'yi ifade ettiği bir suş kullanılarak parlak bir sinyal gösterilerek incelenmiştir. Bununla birlikte, floresan sinyali, nöronlar uzun süre ışığa maruz kalırsa ağartılır. Bu prosedür, davranışsal veya diğer verileri de içerebilen çok haftalık öğrenci odaklı bir projenin parçası olabilir.
