Este protocolo é uma maneira simples e viável para os estudantes de graduação realizarem pesquisas autênticas que possam levar a resultados publicáveis. A principal vantagem é que os alunos podem realizar pesquisas originais sobre questões que decidem por conta própria. Para começar, faça um espalhador de solução dobrando cuidadosamente uma pipeta Pasteur de vidro de nove mililitros em uma chama de queimador Bunsen e feche a abertura da pipeta.
Em seguida, o etanol esteriliza o espalhador antes de cada um se espalhar na placa de Petri. Usando uma micropipetter, coloque 100 microlitres da diluição no centro do ágar e espalhe suavemente pela superfície com o espalhador esterilizado. Em seguida, reserve as placas de Petri cobertas e deixe a solução mergulhar na superfície até secar.
Para períodos de exposição maiores que 12 horas, adicione 50 microliters de uma cultura noturna de Escherichia coli às placas antes de adicionar os nematoides, enquanto para experimentos agudos de 12 horas ou menos, não há necessidade de ter E.coli nas placas. Usando uma micropipette, coloque um mililitro de água estéril na placa de nematoides. Em seguida, swish a água ao redor para levantar os nematoides, em seguida, remover o líquido com os nematoides para um tubo de microfuge de 1,5 mililitro.
Após 10 minutos, à medida que os nematoides se instalaram pela gravidade, remova cuidadosamente pelo menos 500 microliters da água e descarte. Em seguida, resuspenque os nematoides, e usando uma ponta de pipeta amarela de corte, remova 50 a 100 microliters de vermes suspensos em cada placa de tratamento, garantindo que cada placa tenha pelo menos 10 vermes adultos. Prepare dois slides colocando um pedaço de fita de etiqueta em apenas um lado do slide para formar uma almofada de espessura uniforme, em seguida, posicione um slide limpo nãoused entre eles no banco.
Coloque uma gota de 10 microliteres de agarose derretida no centro do slide usando uma micropipetter. Em seguida, achate a gota colocando outro slide limpo no perpendicular superior ao slide com a gota e aplique pressão para que a gota de agarose forme a espessura da fita de rotulagem. Depois, aplique pressão constante para separar os dois slides.
Em seguida, descanse este slide com o lado do ágar para cima no banco e deixe-o secar por um a dois minutos antes de usar. Para adicionar nematoides do slide preparado com a almofada de agarose, adicione uma gota de água de cinco microlitos contendo um azida de sódio molar à almofada de ágar, que irá anestesiar os vermes e mobilizá-los. Em seguida, transfira a 10 nematoides por deslizamento de tratamento para a gotícula usando uma picareta de verme, que deve ser esterilizada antes e depois da transferência dos nematoides.
Em seguida, adicione um deslizamento de tampa usando fórceps colocando-o em um ângulo e lentamente baixando-o. Depois, coloque o suporte molhado preparado em um microscópio fluorescente para observar os vermes primeiro sob ampliação de 10X e contraste de fase, depois sob ampliação de 40X com contraste de fase e iluminação fluorescente. Coloque uma montagem molhada preparada de cada vez no palco do microscópio e se fixe no lugar usando os clipes do palco do microscópio, em seguida, comece a visualizar as montagens molhadas com o objetivo de ampliação mais baixo, que é tipicamente 10X e use um campo ou contraste de fase brilhante para visualizar e focar nos nematoides.
Uma vez que um nematoide esteja localizado no campo de visão, concentre-se nele usando o botão de foco fino no microscópio, em seguida, mude a iluminação para fluorescência girando o mostrador e direcionando a luz para a câmera para capturar as imagens digitais. Em seguida, ajuste a iluminação usando o software de imagem para que os neurônios sejam brilhantemente iluminados, mas não supersaturados. Em algum momento, obtenha uma imagem separada de uma régua na mesma ampliação que as imagens celulares para fornecer uma escala de ampliação para sua figura.
Os efeitos do manganês contendo pesticida na morfologia do neurônio dopamina usando uma cepa na qual os neurônios de dopamina expressavam GFP mostrando um sinal brilhante. No entanto, o sinal fluorescente clareia se os neurônios forem expostos à luz por longos períodos de tempo. Esse procedimento pode fazer parte de um projeto de várias semanas orientado por estudantes que também pode incluir dados comportamentais ou outros.
