Questo protocollo è un modo semplice e fattibile per gli studenti universitari di condurre ricerche autentiche che potrebbero portare a risultati pubblicabili. Il vantaggio principale è che gli studenti possono condurre ricerche originali su domande che decidono da soli. Per iniziare, fare uno spandiluvitore di soluzioni piegando con cura una pipetta Pasteur di vetro da nove millilitri in una fiamma del bruciatore Bunsen e chiudere l'apertura della pipetta.
Quindi l'etanolo sterilizza lo spargitore prima di ogni diffusione sulla piastra di Petri. Utilizzando un micropipettero, posizionare 100 microlitri della diluizione sul centro dell'agar e distribuire delicatamente sulla superficie con lo spargitore sterilizzato. Quindi mettere da parte le piastre di Petri coperte e lasciare la soluzione in ammollo in superficie fino a quando non si asciuga.
Per periodi di esposizione superiori a 12 ore, aggiungere 50 microlitri di una coltura notturna di Escherichia coli alle piastre prima di aggiungere i nematodi, mentre per esperimenti acuti di 12 ore o meno, non è necessario avere E.coli sulle piastre. Usando una micropipetta, posizionare un millilitro di acqua sterile sulla piastra dei nematodi. Quindi, avvolgere l'acqua per sollevare i nematodi, quindi rimuovere il liquido con i nematodi in un tubo di microfuga da 1,5 millilitri.
Dopo 10 minuti, mentre i nematodi si depositano per gravità, rimuovere con cura almeno 500 microlitri dell'acqua e scartare. Quindi risospese i nematodi e, utilizzando una punta della pipetta gialla tagliata, rimuovere da 50 a 100 microlitri di vermi sospesi in ogni piastra di trattamento, assicurandosi che ogni piastra abbia almeno 10 vermi adulti. Preparare due diapositive posizionando un pezzo di nastro adesivo su un solo lato del vetrino per formare un tampone di spessore uniforme, quindi posizionare un vetrino inutilizzato pulito tra di loro sul piano di lavoro.
Posizionare una goccia di 10 microlitri di agarosio fuso al centro del vetrino usando un micropipettero. Quindi appiattire la goccia posizionando un'altra diapositiva pulita sulla parte superiore perpendicolare alla diapositiva con la goccia e applicare una pressione in modo che la goccia di agarosio formi lo spessore del nastro adesivo. Successivamente, applicare una pressione costante per separare le due diapositive.
Quindi appoggiare questo vetrino con il lato dell'agar sul piano di lavoro e lasciarlo asciugare per uno o due minuti prima dell'uso. Per aggiungere nematodi del vetrino preparato con il tampone di agarosio, aggiungere una goccia d'acqua di cinque microlitri contenente un azide di sodio molare al tampone di agar, che anestetizzerà i vermi e li mobiliterà. Quindi trasferire a 10 nematodi per vetrino di trattamento sulla goccia usando un plettro a verme, che deve essere sterilizzato prima e dopo il trasferimento dei nematodi.
Quindi, aggiungi una scivolata di copertura usando una pinza posizionandola ad angolo e abbassandola lentamente. Successivamente, posizionare il supporto bagnato preparato su un microscopio fluorescente per osservare i vermi prima sotto l'ingrandimento 10X e il contrasto di fase, quindi sotto l'ingrandimento 40X con contrasto di fase e illuminazione fluorescente. Posizionare un supporto a umido preparato alla volta sullo stadio del microscopio e fissarlo in posizione utilizzando le clip dello stadio del microscopio, quindi iniziare a visualizzare i supporti bagnati con l'obiettivo di ingrandimento più basso, che in genere è 10X e utilizzare un campo luminoso o un contrasto di fase per visualizzare e concentrarsi sui nematodi.
Una volta che un nematode si trova nel campo visivo, concentrati su di esso usando la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio, quindi passa l'illuminazione alla fluorescenza ruotando il quadrante e dirigi la luce verso la fotocamera per catturare le immagini digitali. Quindi, regolare l'illuminazione utilizzando il software di imaging in modo che i neuroni siano illuminati in modo luminoso, ma non sovrasaturati. Ad un certo punto, ottenere un'immagine separata di un righello allo stesso ingrandimento delle immagini delle celle per fornire una scala di ingrandimento per la loro figura.
Gli effetti del pesticida contenente manganese sulla morfologia dei neuroni della dopamina utilizzando un ceppo in cui i neuroni della dopamina esprimevano GFP sono stati studiati mostrando un segnale luminoso. Tuttavia, il segnale fluorescente sbianca se i neuroni sono esposti alla luce per lunghi periodi di tempo. Questa procedura può far parte di un progetto guidato dagli studenti di più settimane che può anche includere dati comportamentali o di altro tipo.
