Este protocolo permite a auto-organização espontânea de tatoides microtúbulos usando um anti-paralelo cross-linker, MAP65. Este sistema pode nos ajudar a entender a organização de microtúbulos e sistemas biológicos como fusos mitotísticos. A principal vantagem dessa técnica é que é um sistema minimalista que pode recriar formas semelhantes a fusíveis para microtúbulos altamente reprodutíveis e acessíveis a muitos laboratórios.
Este método não é apenas aplicável aos sistemas celulares, mas também pode servir como modelo para estudos de cristal líquido em escala de meso. Para preparar a tubulina, primeiro retire uma alíquota de tubulina sem rótulo contendo um miligrama de tubulina liofilizada do congelador de menos 80 graus Celsius e mantenha-a no gelo. Em seguida, adicione 200 microliters de PEM-80 frios.
Para dissolver todo o liofilato, mantenha o tubo no gelo por 10 minutos. Em seguida, retire um tubo de tubulina com rótulo de rhodamina contendo 20 microgramas de pó de tubulina liofilizada do congelador de menos 80 graus Celsius e mantenha-o no gelo. Em seguida, adicione quatro microliters de PEM-80 frios e mantenha o tubo no gelo por 10 minutos para dissolver todo o lyophilato.
Uma vez que as tubulinas liofilizadas tenham dissolvido, adicione 100 microliters da solução de tubulina sem rótulo resuspended à solução de tubulina de quatro microlitrados com rótulo de rhodamina. Em seguida, misture as soluções por tubulação seis a sete vezes muito lentamente. Para armazenar os 100 microliters restantes da solução de tubulina sem rótulo, primeiro, insira o tubo em nitrogênio líquido para congelar a solução, em seguida, mantenha o tubo a menos 80 graus Celsius para uso futuro.
Em seguida, distribua a mistura de tubulina em sete novos tubos adicionando 15 microliters em cada. Congele os tubos em nitrogênio líquido como demonstrado anteriormente e armazene-os a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Para montar câmaras de fluxo para a realização de experimentos, primeiro, limpe um escorregador de vidro com água duplamente destilada e seque-a com um lenço de laboratório sem fiapos.
Em seguida, limpe o escorregador primeiro com etanol seguido de água duplamente destilada. Para criar um caminho de fluxo, corte um pedaço de fita dupla face de 40 a 50 milímetros. Em seguida, divida-o no meio para criar duas tiras mais finas de fita e coloque as duas tiras no slide de cinco a oito milímetros de distância.
Em seguida, coloque deslizamentos de cobertura silanizados em cima do caminho de fluxo. Em seguida, sele o slide e a tampa escorregou as tiras de fita de dois lados pressionando suavemente a região da fita com a parte de trás de uma caneta. Se o selo for bem feito, a fita deve passar de translúcida para clara.
Para remover a fita extra nas bordas, corte a fita com uma lâmina de barbear, deixando apenas um milímetro da entrada da câmara de fluxo. Em seguida, rotule a câmara com parâmetros experimentais apropriados Para realizar os experimentos de tatoide, primeiro, descongele todos os reagentes necessários no gelo e armazene-os no gelo durante o trabalho. Em seguida, cubra a câmara de fluxo com 20 microlitradores de 5% de bloco não iônico copolímero surfactante dissolvido em PEM-80 com pequenas gotas nas duas extremidades da câmara para evitar a formação de bolhas de ar no interior.
Em seguida, mantenha a câmara de fluxo em uma câmara úmida feita de placa de Petri com um lenço de laboratório molhado e sem fiapos por pelo menos cinco a sete minutos. Em seguida, misture PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothreitol, glicose, polietileno glicol, a mistura de tubulina feita anteriormente, e MAP65 com GFP MAP65 para visualização em um tubo estéril por tubos de cinco a seis vezes, mantendo o tubo no gelo. Em seguida, adicione um microliter de uma solução pré-misturada de glicose oxidase e catalase no tubo da mistura tubulina-MAP e misture novamente por tubulação sete a oito vezes.
Divida o volume total da solução em duas porções a serem usadas em câmaras separadas. Enquanto isso, o líquido adicionado mais cedo à câmara de fluxo deve ser removido por ação capilar usando um lenço de laboratório sem fiapos na outra extremidade da câmara, juntamente com a adição da mistura tubulina-MAP à câmara de fluxo. Uma vez que a amostra esteja totalmente dentro da câmara, sele as duas extremidades da câmara usando epóxi de cinco minutos e mantenha-a a 37 graus Celsius por cerca de 30 minutos para nuclear e cultivar tatoides microtúbulos.
Para a imagem dos tactóides por microscopia de fluorescência, utilize objetivos com uma abertura numérica de 1,2 ou mais em 60X ou ampliação superior para coletar luz suficiente em fluorescência. Grave as imagens com um semicondutor de óxido de metal gratuito ou uma câmera de dispositivo acoplado por carga. Para manter a amostra, mantenha-a em uma câmara ambiental fixada a 37 graus Celsius.
Alternativamente, outros aquecedores de palco, incluindo aquecedores de palco de ar quente e coleiras objetivas controladas pela temperatura com água quente circulante, podem ser empregados para este fim. Como fontes de excitação apropriadas são essenciais para a fluorescência correta para tubulina de rhodamina, use um laser de 561 nanômetros com pelo menos um milímetro de potência na amostra para imagens de boa qualidade. No entanto, para o GFP MAP65, mude a fonte de excitação para um laser de 488 nanômetros.
Se usar microscopia de epifluorescência de campo largo, use um cubo de filtro de rhodamina com uma excitação de 540 12,5 nanômetros,dicroico de 545 nanômetros 12,5 nanômetros de corte e emissão de 575 nanômetros de passagem longa. Para o MAPA GFP, use um cubo de filtro GFP com excitação de 480 15 nanômetros,dicâmico de 505 nanômetros 15 nanômetros cortados e emissão de 515 nanômetros de passagem longa. Depois de garantir que o poder de iluminação e os tempos de exposição sejam tais que a escala de intensidade para a câmera não esteja saturada, leve pelo menos 10 imagens de diferentes áreas para visualizar mais de 100 tatoides nos canais vermelho e verde, e guarde-os como imagens TIFF de 16 bits para análise.
Usando este protocolo, tatoides microtúbulos cuja formação é concluída dentro de 30 minutos podem ser diretamente visualizados sob o microscópio. Os tatoides são visíveis com um laser de 561 nanômetros no canal da tubulina e um laser de 488 nanômetros no canal MAP65. As imagens também se sobrepõem perfeitamente umas com as outras.
Neste método, o comprimento e largura dos tatoides também poderia ser medido. O perfil de intensidade de um tatoide foi encontrado variando com sua largura. Além disso, a natureza imóvel dos táctóides microtubulos foi demonstrada pela recuperação da fluorescência após experimentos foto-branqueamento ou FRAP, que não mostraram qualquer recuperação da fluorescência após o branqueamento fotográfico.
Por outro lado, experimentos FRAP revelaram uma natureza móvel do MAP65, para a qual uma recuperação gradual e fluorescência poderiam ser observadas após o branqueamento fotográfico. Esta recuperação de fluorescência pelo MAP65 pode ser adequada a uma crescente decadência exponencial para encontrar a amplitude e a escala de tempo de recuperação. A parte do experimento tatoide deve ser concluída dentro de 10 a 12 minutos, pois a tubulina pode ir mal no gelo rapidamente, o que pode ser prejudicial à nucleação de tatoides.
O futuro trabalho com diferentes proteínas transversais de microtúbulos e proteínas motoras transversais, enzimas que podem mover microtúbulos, continuarão a expor novas informações sobre a auto-organização do fuso mitotístico.
