Questo protocollo consente l'auto-organizzazione spontanea dei tactoidi dei microtubuli utilizzando un cross-linker anti-parallelo, MAP65. Questo sistema può aiutarci a capire l'organizzazione dei microtubuli e i sistemi biologici come i fusi mitotici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un sistema minimalista in grado di ricreare forme simili a mandrini per microtubuli che è altamente riproducibile e accessibile a molti laboratori.
Questo metodo non è applicabile solo ai sistemi cellulari, ma può anche servire da modello per studi sui cristalli liquidi su mesoscala. Per preparare la tubulina, prima estrarre un'aliquota di tubulina non etichettata contenente un milligrammo di tubulina liofilizzata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e tenerla sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 200 microlitri di PEM-80 freddo.
Per sciogliere tutto il liofilo, tenere il tubo sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, estrarre un tubo di tubulina marcata con rodamina contenente 20 microgrammi di polvere di tubulina liofilizzata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e tenerlo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere quattro microlitri di PEM-80 freddo e mantenere il tubo sul ghiaccio per 10 minuti per sciogliere tutto il liofilato.
Una volta che le tubuline liofilizzate si sono dissolte, aggiungere 100 microlitri della soluzione di tubulina non etichettata risospesa alla soluzione di tubulina marcata con rodamina a quattro microliti. Quindi, mescolare le soluzioni convogliando da sei a sette volte molto lentamente. Per conservare i restanti 100 microlitri di soluzione di tubulina non etichettata, in primo luogo, inserire il tubo in azoto liquido per congelare la soluzione, quindi mantenere il tubo a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.
Quindi, distribuire la miscela di tubuline in sette nuovi tubi aggiungendo 15 microlitri in ciascuno. Congelare i tubi in azoto liquido come dimostrato in precedenza e conservarli a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Per assemblare le camere di flusso per l'esecuzione di esperimenti, in primo luogo, pulire un vetrino con acqua a doppia distillazione e asciugarlo con una salvietta da laboratorio priva di lanugine.
Quindi, pulire prima la diapositiva con etanolo seguito da acqua a doppio distillato. Per creare un percorso di flusso, tagliare un pezzo di nastro biadesivo lungo da 40 a 50 millimetri. Quindi, dividerlo tra loro per creare due strisce di nastro più sottili e posizionare le due strisce sulla diapositiva da cinque a otto millimetri di distanza.
Quindi, posizionare gli scivoli di copertura silanizzati sulla parte superiore del percorso del flusso. Quindi, sigillare il vetrino e coprire le strisce di nastro biadesivo premendo delicatamente sulla regione del nastro con il retro di una penna. Se il sigillo è fatto bene, il nastro dovrebbe passare da traslucido a trasparente.
Per rimuovere il nastro extra sui bordi, tagliare il nastro con una lama di rasoio, lasciando solo un millimetro dall'ingresso della camera di flusso. Quindi, etichettare la camera con parametri sperimentali appropriati Per eseguire gli esperimenti tactoidi, in primo luogo, scongelare tutti i reagenti necessari sul ghiaccio e conservarli sul ghiaccio durante il lavoro. Successivamente, rivestire la camera di flusso con 20 microlitri di tensioattivo copolimero a blocchi non ionici al 5% disciolto in PEM-80 con piccole gocce ad entrambe le estremità della camera per prevenire la formazione di bolle d'aria all'interno.
Quindi, tenere la camera di flusso in una camera umida fatta di capsula di Petri con una salvietta da laboratorio bagnata e priva di lanugine per almeno cinque-sette minuti. Successivamente, mescolare PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, ditiotreitolo, glucosio, polietilenglicole, la miscela di tubuline prodotta in precedenza e MAP65 con GFP MAP65 per la visualizzazione in un tubo sterile pipettando da cinque a sei volte, mantenendo il tubo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un microlitro di una soluzione premiscelata di glucosio ossidasi e catalasi nel tubo della miscela tubulina-MAP e mescolare di nuovo convogliando da sette a otto volte.
Dividere il volume totale della soluzione in due porzioni da utilizzare in camere separate. Nel frattempo, il liquido aggiunto in precedenza alla camera di flusso deve essere rimosso per azione capillare utilizzando una salvietta da laboratorio priva di lanugine all'altra estremità della camera, insieme all'aggiunta della miscela tubulina-MAP alla camera di flusso. Una volta che il campione è completamente all'interno della camera, sigillare le due estremità della camera usando resina epossidica di cinque minuti e tenerlo a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti per nucleare e far crescere i tactoidi dei microtubuli.
Per l'imaging dei tactoidi mediante microscopia a fluorescenza, utilizzare obiettivi con un'apertura numerica di 1,2 o più in ingrandimento 60X o superiore per raccogliere abbastanza luce in fluorescenza. Registrare le immagini con un semiconduttore di ossido di metallo gratuito o una fotocamera ad accoppiamento di carica. Per mantenere il campione, tenerlo in una camera ambientale impostata a 37 gradi Celsius.
In alternativa, altri riscaldatori a stadi, tra cui riscaldatori ad aria calda e collari a temperatura controllata obiettiva con acqua calda circolante, possono essere utilizzati per questo scopo. Poiché le fonti di eccitazione appropriate sono essenziali per la corretta fluorescenza per la tubulina rodamina, utilizzare un laser a 561 nanometri con almeno un milliwatt di potenza sul campione per immagini di buona qualità. Tuttavia, per GFP MAP65, modificare la sorgente di eccitazione in un laser a 488 nanometri.
Se si utilizza la microscopia a epifluorescenza a campo largo, utilizzare un cubo di filtro rodaminico con un'eccitazione di 540 12,5 nanometri, dicroico di 545 nanometri 12,5 nanometri di cutoff ed emissione di 575 nanometri di passaggio lungo. Per GFP MAP, utilizzare un cubo filtrante GFP con eccitazione di 480 15 nanometri, dicroico di 505 nanometri 15 nanometri tagliato ed emissione di 515 nanometri long-pass. Dopo esserti assicurato che la potenza di illuminazione e i tempi di esposizione siano tali che la scala di intensità per la fotocamera non sia satura, scatta almeno 10 immagini di aree diverse per visualizzare oltre 100 tactoidi nei canali rosso e verde e salvale come immagini TIFF a 16 bit per l'analisi.
Utilizzando questo protocollo, i tactoidi microtubuli la cui formazione viene completata entro 30 minuti possono essere visualizzati direttamente al microscopio. I tactoidi sono visibili sia con un laser a 561 nanometri nel canale della tubulina che con un laser a 488 nanometri nel canale MAP65. Anche le immagini si sovrappongono perfettamente l'una con l'altra.
In questo metodo, è possibile misurare anche la lunghezza e la larghezza dei tactoidi. Il profilo di intensità di un tactoide è risultato variare con la sua larghezza. Inoltre, la natura immobile dei tactoidi dei microtubuli è stata dimostrata dal recupero della fluorescenza dopo esperimenti di foto-sbiancamento o FRAP, che non hanno mostrato alcun recupero di fluorescenza dopo il foto-sbiancamento.
D'altra parte, gli esperimenti FRAP hanno rivelato una natura mobile di MAP65, per la quale è stato possibile osservare un graduale recupero e fluorescenza dopo il foto-sbiancamento. Questo recupero di fluorescenza da parte di MAP65 può essere adattato a un decadimento esponenziale crescente per trovare l'ampiezza e la scala temporale del recupero. La parte dell'esperimento tattile dovrebbe essere completata entro 10-12 minuti, poiché la tubulina può andare a male sul ghiaccio rapidamente, il che può essere dannoso per la nucleazione dei tactoidi.
Il lavoro futuro con diverse proteine reticolanti di microtubuli e proteine motorie reticolanti, enzimi in grado di spostare microtubuli, continuerà a esporre nuove informazioni sull'auto-organizzazione del fuso mitotico.
