이 프로토콜은 항-병렬 가교결합제, MAP65를 사용하여 미세소관 촉각제의 자발적인 자가조직을 가능하게 한다. 이 시스템은 미세 소관 조직과 유사 분열 스핀들과 같은 생물학적 시스템을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 재현성이 뛰어나고 많은 실험실에서 접근 할 수있는 미세 소관에 스핀들과 같은 모양을 재현 할 수있는 최소한의 시스템이라는 것입니다.
이 방법은 세포 시스템에 적용 할 수있을뿐만 아니라 메조 스케일 액정 연구의 모델로도 사용할 수 있습니다. 튜불린을 준비하려면 먼저 영하 80도 냉동고에서 동결 건조 된 튜불린 한 밀리그램을 함유 한 라벨되지 않은 튜불린의 분취량을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 차가운 PEM-80 200 마이크로 리터를 넣으십시오.
모든 동결 건조물을 용해시키려면 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 보관하십시오. 다음으로, 영하 80도 냉동고에서 동결건조된 튜불린 분말 20마이크로그램이 들어있는 로다민 표지된 튜불린 튜브를 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 네 마이크로 리터의 차가운 PEM-80을 첨가하고 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 유지하여 모든 동결 건조물을 용해시킵니다.
일단 동결건조된 튜불린이 용해되면, 재현탁된 표지되지 않은 튜불린 용액 100 마이크로리터를 네 마이크로리터 로다민 표지된 튜불린 용액에 첨가한다. 그런 다음 여섯 번에서 일곱 번 매우 천천히 파이핑하여 용액을 혼합하십시오. 나머지 100 마이크로 리터의 표지되지 않은 튜불린 용액을 저장하려면 먼저 튜브를 액체 질소에 삽입하여 용액을 동결 한 다음 튜브를 영하 80 °C로 유지하여 나중에 사용하십시오.
다음으로, 튜불린 믹스를 각각 15 마이크로리터를 추가하여 일곱 개의 새로운 튜브에 분배한다. 이전에 입증 된 바와 같이 액체 질소로 튜브를 동결시키고 나중에 사용할 수 있도록 영하 80도에 보관하십시오. 실험을 수행하기 위해 유동 챔버를 조립하려면 먼저 이중 증류수로 유리 슬라이드를 청소하고 보풀이없는 실험실 닦음으로 건조하십시오.
다음으로, 슬라이드를 먼저 에탄올로 세척한 다음 이중 증류수로 세척한다. 흐름 경로를 만들려면 40~50mm 길이의 양면 테이프를 자릅니다. 그런 다음 두 개의 더 얇은 테이프 스트립을 만들고 두 개의 스트립을 슬라이드에 다섯 밀리미터에서 여덟 밀리미터 간격으로 놓습니다.
그런 다음 실란화 된 커버 슬립을 흐름 경로 위에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 밀봉하고 펜 뒷면으로 테이프 영역을 부드럽게 눌러 양면 테이프 스트립을 덮었습니다. 씰이 잘 만들어지면 테이프가 반투명에서 투명으로 바뀌어야합니다.
가장자리에 있는 여분의 테이프를 제거하려면 면도날로 테이프를 자르고 유량실 입구에서 한 밀리미터만 남겨 둡니다. 그런 다음 챔버에 적절한 실험 매개 변수를 라벨링하여 선탠토이드 실험을 수행하기 위해 먼저 필요한 모든 시약을 얼음에 해동하고 작업 중에 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, PEM-80에 용해 된 20 마이크로 리터의 5 % 비이온성 블록 공중합체 계면 활성제로 유동 챔버를 챔버의 양쪽 끝에서 작은 방울로 코팅하여 내부에 기포가 형성되는 것을 방지하십시오.
그런 다음 유동 챔버를 젖은 보풀이없는 실험실 닦음으로 페트리 접시로 만든 습한 챔버에 적어도 다섯 ~ 일곱 분 동안 닦으십시오. 다음으로, PEM-80, GMPPCPP, 플루로닉 F-127, 디티오트레이톨, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 튜불린 믹스를 앞서 만든 튜불린 믹스, 그리고 MAP65를 GFP MAP65와 혼합하여 튜브를 얼음 위에 유지하여 멸균 튜브에서 5 ~ 6 번 피펫팅하여 멸균 튜브에서 시각화합니다. 이어서, 글루코스 옥시다제와 카탈라아제의 미리 혼합된 용액 중 한 마이크로리터를 튜불린-MAP 혼합물의 튜브에 첨가하고, 일곱 내지 여덟 번 파이핑하여 다시 혼합한다.
용액의 총 부피를 별도의 챔버에서 사용할 두 부분으로 나눕니다. 한편, 유동 챔버에 이전에 첨가된 액체는 튜불린-MAP 믹스를 유동 챔버에 첨가하는 것과 함께 챔버의 다른 쪽 끝에서 보풀이 없는 실험실 와이프를 사용하여 모세관 작용에 의해 제거되어야 한다. 샘플이 챔버 내부에 완전히 들어가면 5 분 에폭시를 사용하여 챔버의 두 끝을 밀봉하고 약 30 분 동안 섭씨 37도에서 유지하여 미세 소관 촉각을 핵으로 만들고 성장시킵니다.
형광 현미경으로 촉각을 이미징하려면 형광에서 충분한 빛을 수집하기 위해 60X 이상의 배율에서 1.2 이상의 수치 조리개를 가진 목표를 사용하십시오. 무료 금속 산화물 반도체 또는 전하 결합 장치 카메라로 이미지를 녹화합니다. 샘플을 유지하려면 섭씨 37도로 설정된 환경 챔버에 보관하십시오.
대안으로, 열풍 스테이지 히터 및 순환하는 따뜻한 물을 갖는 객관적인 온도 제어 칼라를 포함한 다른 스테이지 히터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 로다민 튜불린의 정확한 형광을 위해 적절한 여기 소스가 필수적이므로 양질의 이미지를 위해 샘플에서 적어도 하나의 밀리와트의 전력을 가진 561나노미터 레이저를 사용하십시오. 그러나 GFP MAP65의 경우 여기 소스를 488 나노 미터 레이저로 변경하십시오.
광역 후광 형광 현미경을 사용하는 경우 540 12.5 나노 미터의 여기, 545 나노 미터의 이색성 12.5 나노 미터 컷오프 및 575 나노 미터 길이의 방출을 가진 로다민 필터 큐브를 사용하십시오. GFP MAP의 경우, 480 15 나노미터의 여기, 505 나노미터의 이색성 15 나노미터의 컷오프 및 515 나노미터 롱 패스의 방출이 있는 GFP 필터 큐브를 사용하십시오. 카메라의 강도 스케일이 포화되지 않도록 조명 전력과 노출 시간이 되도록 한 후 서로 다른 영역의 최소 10개 이상의 이미지를 촬영하여 적색 및 녹색 채널 모두에서 100개 이상의 촉각을 촬영하고 분석을 위해 16비트 TIFF 이미지로 저장합니다.
이 프로토콜을 사용하면 30 분 이내에 형성이 완료된 미세 소관 촉각류를 현미경으로 직접 시각화 할 수 있습니다. 촉각은 튜불린 채널의 561 나노 미터 레이저와 MAP65 채널의 488 나노 미터 레이저로 볼 수 있습니다. 이미지는 또한 서로 완벽하게 겹칩니다.
이 방법에서는 촉각제의 길이와 너비도 측정 할 수 있습니다. 선인장의 강도 프로파일은 폭에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 미세소관 촉각의 불이동성 성질은 광표백 또는 FRAP 실험 후의 형광 회복에 의해 입증되었으며, 이는 광표백 후 형광의 어떠한 회복도 나타내지 않았다.
한편, FRAP 실험은 MAP65의 이동성 특성을 밝혀 냈으며, 이는 광표백 후 점진적인 회복과 형광을 관찰 할 수있었습니다. MAP65에 의한 이러한 형광 회복은 회복의 진폭 및 시간 척도를 찾기 위해 상승하는 지수 붕괴에 적합할 수 있다. 선인장 실험 부분은 튜불린이 얼음에서 빨리 나빠질 수 있으므로 10 ~ 12 분 이내에 완료되어야하며, 이는 촉각의 핵에 해로울 수 있습니다.
다른 미세 소관 가교 단백질과 가교 운동 단백질, 미세 소관을 움직일 수있는 효소와의 향후 연구는 유사 분열 스핀들의 자기 조직에 대한 새로운 정보를 계속 노출 할 것입니다.
