Este protocolo permite la autoorganización espontánea de tactoides de microtúbulos utilizando un enlace cruzado antiparalelo, MAP65. Este sistema puede ayudarnos a comprender la organización de los microtúbulos y los sistemas biológicos como los husos mitóticos. La principal ventaja de esta técnica es que es un sistema minimalista que puede recrear formas similares a husos para microtúbulos que es altamente reproducible y accesible para muchos laboratorios.
Este método no solo es aplicable a los sistemas celulares, sino que también puede servir como modelo para estudios de cristal líquido a mesoescala. Para preparar tubulina, primero saque una alícuota de tubulina sin etiquetar que contenga un miligramo de tubulina liofilizada del congelador de menos 80 grados centígrados y manténgala en hielo. Luego, agregue 200 microlitros de PEM-80 frío.
Para disolver todo el liofilato, mantenga el tubo en hielo durante 10 minutos. A continuación, saque un tubo de tubulina marcada con rodamina que contenga 20 microgramos de polvo de tubulina liofilizada del congelador de menos 80 grados centígrados y manténgalo en hielo. Luego, agregue cuatro microlitros de PEM-80 frío y mantenga el tubo en hielo durante 10 minutos para disolver todo el liofilato.
Una vez que las tubulinas liofilizadas se hayan disuelto, agregue 100 microlitros de la solución de tubulina sin etiquetar resuspendida a la solución de tubulina marcada con rodamina de cuatro microlitros. Luego, mezcle las soluciones canalizando de seis a siete veces muy lentamente. Para almacenar los 100 microlitros restantes de solución de tubulina sin etiquetar, primero, inserte el tubo en nitrógeno líquido para congelar la solución, luego mantenga el tubo a menos 80 grados Celsius para su uso futuro.
A continuación, distribuya la mezcla de tubulina en siete tubos nuevos agregando 15 microlitros en cada uno. Congele los tubos en nitrógeno líquido como se demostró anteriormente y guárdelos a menos 80 grados centígrados para su uso futuro. Para ensamblar cámaras de flujo para realizar experimentos, primero, limpie un portaobjetos de vidrio con agua de doble destilación y séquelo con una toallita de laboratorio sin pelusa.
A continuación, limpie el portaobjetos primero con etanol seguido de agua de doble destilación. Para crear una ruta de flujo, corte una pieza de cinta de doble cara de 40 a 50 milímetros de largo. Luego, divídalo en el medio para crear dos tiras de cinta más delgadas y coloque las dos tiras en la diapositiva de cinco a ocho milímetros de distancia.
A continuación, coloque los resbalones de cubierta silanizados en la parte superior de la trayectoria del flujo. Luego, selle la diapositiva y cubra las tiras de cinta de doble cara presionando suavemente la región de la cinta con la parte posterior de un bolígrafo. Si el sello está bien hecho, la cinta debe pasar de translúcida a transparente.
Para quitar la cinta adicional en los bordes, corte la cinta con una cuchilla de afeitar, dejando solo un milímetro de la entrada de la cámara de flujo. Luego, etiquete la cámara con los parámetros experimentales apropiados Para realizar los experimentos tactoides, primero, descongele todos los reactivos necesarios en el hielo y guárdelos en el hielo durante el trabajo. A continuación, cubra la cámara de flujo con 20 microlitros de surfactante de copolímero de bloque no iónico al 5% disuelto en PEM-80 con pequeñas gotas en ambos extremos de la cámara para evitar la formación de burbujas de aire en el interior.
Luego, mantenga la cámara de flujo en una cámara húmeda hecha de placa de Petri con una toallita de laboratorio húmeda y sin pelusa durante al menos cinco a siete minutos. A continuación, mezcle PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, ditiotreitol, glucosa, polietilenglicol, la mezcla de tubulina hecha anteriormente, y MAP65 con GFP MAP65 para su visualización en un tubo estéril mediante pipeteo de cinco a seis veces, manteniendo el tubo en hielo. Luego, agregue un microlitro de una solución premezclada de glucosa oxidasa y catalasa en el tubo de la mezcla de tubulina-MAP y mezcle nuevamente por tubería de siete a ocho veces.
Divida el volumen total de la solución en dos porciones para utilizarlas en cámaras separadas. Mientras tanto, el líquido agregado antes a la cámara de flujo debe eliminarse por acción capilar mediante el uso de una toallita de laboratorio sin pelusa en el otro extremo de la cámara, junto con la adición de la mezcla tubulina-MAP a la cámara de flujo. Una vez que la muestra esté completamente dentro de la cámara, selle los dos extremos de la cámara con epoxi de cinco minutos y manténgala a 37 grados centígrados durante unos 30 minutos para nuclear y hacer crecer los tactoides de microtúbulos.
Para obtener imágenes de los tactoides mediante microscopía de fluorescencia, use objetivos con una apertura numérica de 1.2 o más en un aumento de 60X o superior para recolectar suficiente luz en fluorescencia. Grabe las imágenes con un semiconductor de óxido metálico de cortesía o una cámara de dispositivo de carga acoplada. Para mantener la muestra, manténgala en una cámara ambiental a 37 grados centígrados.
Alternativamente, se pueden emplear otros calentadores de etapa, incluidos los calentadores de etapa de aire caliente y los collares objetivos de temperatura controlada con agua tibia circulante, para este propósito. Como las fuentes de excitación apropiadas son esenciales para la correcta fluorescencia de la rodamina tubulina, use un láser de 561 nanómetros con al menos un milivatio de potencia en la muestra para obtener imágenes de buena calidad. Sin embargo, para GFP MAP65, cambie la fuente de excitación a un láser de 488 nanómetros.
Si usa microscopía de epifluorescencia de campo amplio, use un cubo de filtro de rodamina con una excitación de 540 12.5 nanómetros, dicroico de 545 nanómetros de corte de 12.5 nanómetros y emisión de 575 nanómetros de paso largo. Para GFP MAP, use un cubo de filtro GFP con excitación de 480 15 nanómetros, dicroico de 505 nanómetros 15 nanómetros cortado y emisión de 515 nanómetros de paso largo. Después de asegurarse de que la potencia de iluminación y los tiempos de exposición sean tales que la escala de intensidad de la cámara no esté saturada, tome al menos 10 imágenes de diferentes áreas para obtener imágenes de más de 100 tactoides en los canales rojo y verde, y guárdelas como imágenes TIFF de 16 bits para su análisis.
Usando este protocolo, los tactoides de microtúbulos cuya formación se completa en 30 minutos se pueden visualizar directamente bajo el microscopio. Los tactoides son visibles con un láser de 561 nanómetros en el canal de tubulina y un láser de 488 nanómetros en el canal MAP65. Las imágenes también se superponen perfectamente entre sí.
En este método, también se podría medir la longitud y el ancho de los tactoides. Se encontró que el perfil de intensidad de un tactoide varía con su ancho. Además, la naturaleza inmóvil de los tactoides de microtúbulos se demostró mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo o experimentos FRAP, que no mostraron ninguna recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo.
Por otro lado, los experimentos FRAP revelaron una naturaleza móvil de MAP65, para la cual se pudo observar una recuperación gradual y fluorescencia después del fotoblanqueo. Esta recuperación de fluorescencia por MAP65 puede ajustarse a una desintegración exponencial creciente para encontrar la amplitud y la escala de tiempo de recuperación. La parte del experimento tactoide debe completarse dentro de 10 a 12 minutos, ya que la tubulina puede estropearse en el hielo rápidamente, lo que puede ser perjudicial para la nucleación de los tactoides.
El trabajo futuro con diferentes proteínas de reticulación de microtúbulos y proteínas motoras de reticulación, enzimas que pueden mover microtúbulos, continuará exponiendo nueva información sobre la autoorganización del huso mitótico.
