Bir uzvun hücresellikten arındırılması için küçük bir hayvan modeli oluşturduk. Bu, vaskülarize kompozit dokuların de ve resellülarizasyonu üzerine kavram kanıtı araştırmalarını kolaylaştırmak için yararlıdır. İmmünsüpresyon rejimleri vaskülarize kompozit allotransplantasyonda başlıca sınırlamalardan biridir.
Doku immünojenisitesi, desellülarizasyon kullanılarak azaltılabilir. Başlamak için, kasık bağı boyunca 10 numaralı cerrahi bıçak kullanarak, yanal bir yönden medial bir yöne doğru hareket ederken, çevredeki cildi Adson Forseps ile tutarken bir cilt kesisi yapın. Altta yatan yağ açığa çıktığında, yağdan dikkatlice diseksiyon yapmak ve üstün epigastrik damarları bulmak için künt diseksiyon kullanın.
Mikro makas kullanarak, proksimal olarak diseksiyon yapın ve altta yatan femoral siniri, arteri ve veni inguinal ligament seviyesinde açığa çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, femoral damarları tanımlayın ve arteriyel ağın bifurkasyon noktalarından yeterli uzunluk elde etmek için ince forseps kullanarak arteri ve veni proksimal olarak diseke edin. Daha sonra, femoral veni ve arteri 6-0 dikiş kullanarak ayrı ayrı bağlayın.
Daha sonra, bağlı femur damarlarını bozmadan arka bacağın geri kalanı etrafında çevresel diseksiyon yapın ve bir kemik kesici kullanarak femur kemiğini orta uzunlukta transekte edin. Arka bacağı tamamen izole etmek için, mikro makas kullanarak ligatürlere distal bağlanmış femur damarlarını transekte edin ve diseksiyon mikroskobu altında 24 gauge anjiyokateter kullanarak femoral arteri kanüle edin. Daha sonra, femoral venden net bir çıkış gözlenene kadar heparinize salin ile yıkayın.
Kanülün etrafındaki bir dikişi, kanülün etrafındaki başka bir dikişe distal olarak bağlayarak, çatallanma noktalarının tıkanmasını önlemek için kanülün yakınına yerleştirilmesini sağlayarak kanülü sabitleyin. Daha sonra, tedarik edilen arka bacakları ve PBS'yi desellülarizasyona kadar batırın. Biyoreaktörü inşa etmek için, sterilize edilmiş odayı yerleştirin ve giriş, çıkış ve ikmal hatlarındaki üç tek kullanımlık üç yönlü stopcock'a vidalayın, böylece ikmal portunun stopcock'unun sızıntıyı önlemek için kalan iki portunda kapatılmasını sağlayın.
Daha önce yapılmış silikon tüpleri giriş ve çıkış hatlarındaki stopcocklara takın. Ardından, peristaltik boruları silikon tüplere bağlayın. Kaseti peristaltik boru üzerine sabitledikten sonra, peristaltik pompaya yerleştirin.
Ardından, silikon tüplerden birini, yukarıdaki adımdan çıkış hattının peristaltik borusunun sonuna bağlayın. Diğer tarafta, bir mililitrelik serolojik pipet bağlayın ve atık haznesi şişesinde serolojik bir pipetle tutturulmuş ucu yeniden askıya alın. Daha sonra, serolojik pipete bağlı tüpün ucunu deterjan rezervuarına askıya alın ve deterjan haznesi şişesinin açıklığını hemen parafilm ile kapatın.
Bir litrelik cam kavanozdan% 0.25 SDS'yi yarı yolda biyoreaktör odasına ekleyin. Ardından, Adson Forseps kullanarak tedarik edilen arka bacağı alın ve biyoreaktör odasına dikkatlice askıya alın. İki çift Adson Forseps kullanarak, kanülü bir çift forseps ile tutarken arka bacağın kanüllenmiş kısmını giriş çizgisine yönlendirin.
Giriş hattını kanüle bükmek ve sabitlemek için diğer forseps çiftini kullanın. Sabitlendikten sonra, uzuvları gerektiği gibi tamamen batırmak için bir litrelik cam kavanozdan% 0.25 daha fazla% SDS ekleyin, çıkış portunun da biyoreaktör rezervuarına batırılmasını ve tutarlı çıkışın korunmasını sağlayın. Ardından, biyoreaktör odasının kapağındaki havalandırma portuna tek kullanımlık bir şırınga filtresi takın ve kapağı biyoreaktör üzerine sabitleyerek odanın her taraftan kapatılmasını sağlayın.
Havayı borudan çıkarmak ve perfüzyon devresini hazırlamak için, giriş hattında üç yönlü bir stopcock kullanarak deterjanı deterjan haznesinden çekmek için yeni bir tek kullanımlık 10 mililitre şırınga kullanın. Çekildikten sonra, çıkış hattındaki üç yönlü stopcock'a yerleştirmek için aynı sıvıyı kullanın. Ardından, kasetleri aşağı bastırın ve borulu peristaltik pompaya sabitleyin.
Ardından, güç düğmesini kullanarak peristaltik pompayı açın. Peristaltik pompa ekranında, giriş akış hızı ile ilk kanalın perfüzyon hızını teslimat şekli olarak ayarlamak için ok tuşunu kullanarak ikinci sekmeye geçin ve perfüzyon hızını dakikada bir mililitre olarak ayarlayarak akış yönünün cihaz kurulumuna göre doğru olmasını sağlayın. Giriş hattından iletilen ve/veya çıkış hattından alınan sıvı miktarının ikisi arasında tutarlı bir şekilde aktığından emin olmak için peristaltik pompayı kalibre edin ve boru kimliğinin 1,85 milimetreye ayarlanmasını sağlayın.
Tuş takımındaki güç düğmesine basarak hem giriş hem de çıkış hatları için dakikada bir mililitrede makine perfüzyonu yoluyla hücre desellülarizasyonuna başlayın. Akışın hem giriş hem de çıkış hatlarında olup olmadığını ve devam ettiğini izleyin ve emin olun. 1 litre% 0.25 STS kullanarak, biyoreaktör rezervuarını gerektiğinde yenileme portundan doldurun.
Daha sonra, beşinci güne kadar ortaya çıkacak olan ve sıçan arka bacaklarının hücresellikten arındırıldığını gösteren dokunun beyaz yarı saydam bir görünümünü arayın. Desellülarizasyonun onaylanmasını takiben, deterjan haznesini PBS ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik rezervuar ile değiştirin ve şişenin açıklığını parafilm ile kapatın. PBS ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik perfüzyona dakikada bir mililitrede başlayın ve iki gün boyunca devam edin.
PBS ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik rezervuarı 200 mililitre% 0.1 paraziter asit,% 4 etanol rezervuarı ile değiştirin ve iki saat boyunca dakikada bir mililitrede perfüzyona başlayın. Bir biyogüvenlik kabini altında, giriş hattını bükmek için bir çift forseps ile iki çift steril Adson Forseps kullanarak arka bacağı giriş hattından ayırın ve diğeri kanülü tutarak, kanülün silinmeyi önlemek için çekilmemesini sağlayın. Uzuvları PBS içeren 500 mililitrelik bir cam kavanozda ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik'i daha fazla kullanana kadar 4 santigrat derecede saklayın.
Hem desellülarize femoral arter hem de ven, doğal damarlarda aksi takdirde mevcut olan mavi lekeli çekirdeklerin eksikliği göz önüne alındığında, tüm katmanlarda ve çevreleyen bağ dokusunda nükleer içerik kaybı gösterdi. Tunika intima media ve hem femoral ven hem de arterlerin adventitisi desellülarize damarlarda tutuldu. Femoral sinir, endoneurium da dahil olmak üzere doku yapısının korunduğunu gösterdi.
Kemik, osteositlerin lekeli çekirdeklerinin kaybı ve desellülarizasyon sonrası çevredeki endosteum ve periost tabakalarından genel yapısal retansiyon gösterdi. Deri, epidermis ve dermisten hücre kaybı gösterdi. Dermis, doğal cilt dokusuna benzer şekilde tutulan kollajen lifleri gösterdi.
Son olarak, iskelet kasının enine görünümü, endomisyumun çevrelerinde bulunan çekirdek kaybını gösterdi. Miyofibril içeriği, desellülarizasyon sonrası ilgili fasiküller içinde tutulmaya devam etti. PicoGreen kullanılarak DNA nicelleştirmesi de gerçekleştirildi, burada DNA içeriği femur damarları, sinir, cilt, kas ve kemik boyunca önemli ölçüde azaldı.
Bu protokolü takiben, desellülarize uzuv daha da karakterize edilebilir. Bu, hücre dışı matriksin hem histolojik hem de biyokimyasal yöntemler kullanılarak incelenmesini ve görüntülemede vaskülerin değerlendirilmesini içerir. Desellülarize gövde, dokuya özgü hücreler kullanılarak yeniden hücreselleştirilebilir.
