우리는 사지의 탈세포화를 위한 작은 동물 모델을 구축했습니다. 이는 혈관화된 복합 조직의 de 및 재세포화에 대한 개념 증명 연구를 용이하게 하는 데 유용합니다. 면역 억제 요법은 혈관 화 복합 동종 이식의 주요 한계 중 하나입니다.
조직 면역원성은 탈세포화를 사용하여 감소될 수 있다. 시작하려면 사타구니 인대를 따라 10 번 수술 블레이드를 사용하여 Adson Forceps로 주변 피부를 유지하면서 측면에서 내측 방향으로 이동하여 피부 절개를하십시오. 밑에있는 지방이 노출되면 무딘 해부를 사용하여 지방을 조심스럽게 해부하고 상복부 혈관을 찾습니다.
마이크로 가위를 사용하여 근위를 해부하고 사타구니 인대 수준에서 밑에있는 대퇴 신경, 동맥 및 정맥을 노출시킵니다. 해부 현미경으로 대퇴 혈관을 식별하고 미세한 집게를 사용하여 동맥과 정맥을 근위로 해부하여 동맥 네트워크의 분기점에서 충분한 길이를 얻습니다. 그런 다음 6-0 봉합사를 사용하여 대퇴 정맥과 동맥을 별도로 결찰합니다.
다음으로, 결찰된 대퇴 혈관을 방해하지 않고 뒷다리의 나머지 부분을 원주 박리하고 뼈 절단기를 사용하여 대퇴골 중간 길이를 횡단합니다. 뒷다리를 완전히 분리하려면 마이크로 가위를 사용하여 합자 원위에있는 결찰 된 대퇴 혈관을 횡단하고 해부 현미경으로 24 게이지 혈관 카테터를 사용하여 대퇴 동맥을 캐뉼레이션합니다. 그런 다음 대퇴 정맥에서 명확한 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수로 씻어냅니다.
캐뉼러 자체 주변의 다른 봉합사에서 캐뉼러 용기 주위에 하나의 봉합사를 묶어 캐뉼러를 고정하고 캐뉼러가 분기점을 막지 않도록 근위부에 배치되도록합니다. 그 후, 조달 된 뒷다리와 PBS를 탈세포화 될 때까지 담그십시오. 생물 반응기를 건설하려면 멸균 된 챔버를 배치하고 입구, 출구 및 보충 라인에 3 개의 일회용 3 방향 스톱 콕을 조여 보충 포트의 스톱 콕이 누출을 방지하기 위해 나머지 2 개의 포트에 캡핑되도록합니다.
이전에 만든 실리콘 튜브를 입구 및 출구 라인의 스톱 콕에 부착하십시오. 그런 다음 연동 튜브를 실리콘 튜브에 연결합니다. 카세트를 연동 튜브에 고정한 후 연동 펌프에 놓습니다.
그런 다음 실리콘 튜브 중 하나를 위 단계에서 배출 라인의 연동 튜브 끝에 연결합니다. 다른 쪽 끝에는 1 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 연결하고 혈청 학적 피펫으로 부착 된 끝을 폐기물 저장소 플라스크에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 혈청 피펫에 부착 된 튜브의 끝을 세제 저장소에 매달고 즉시 세제 저장소 플라스크의 개구부를 파라 필름으로 밀봉합니다.
1 리터 유리 병에서 0.25 % SDS를 중간 수준의 생물 반응기 챔버에 추가합니다. 그런 다음 Adson Forceps를 사용하여 조달 된 뒷다리를 가져 와서 생물 반응기 챔버에 조심스럽게 매달아 놓습니다. 두 쌍의 Adson 겸자를 사용하여 한 쌍의 집게로 캐뉼러를 잡고 뒷다리의 캐뉼러 부분을 입구 라인으로 안내합니다.
다른 한 쌍의 집게를 사용하여 입구 라인을 캐뉼라에 비틀고 고정합니다. 일단 고정되면 1 리터 유리 병에서 0.25 % SDS를 더 추가하여 필요에 따라 사지를 완전히 잠수시켜 출구 포트도 생물 반응기 저장소에 잠기고 일관된 유출이 유지되도록합니다. 그런 다음 일회용 주사기 필터를 생물 반응기 챔버 뚜껑의 환기구에 부착하고 생물 반응기의 뚜껑을 고정하여 챔버가 모든면에서 밀봉되도록합니다.
튜브에서 공기를 제거하고 관류 회로를 프라이밍하려면 새로운 일회용 10 밀리리터 주사기를 사용하여 입구 라인에서 3 방향 스톱 콕을 사용하여 세제 저장소에서 세제를 끌어옵니다. 일단 당겨지면 동일한 유체를 사용하여 출구 라인의 3 방향 스톱 콕에 삽입하십시오. 그런 다음 튜브가있는 카세트를 아래로 눌러 연동 펌프에 고정합니다.
그런 다음 전원 버튼을 사용하여 연동 펌프를 켭니다. 연동 펌프 화면에서 화살표 키를 사용하여 두 번째 탭으로 이동하여 입력 유량을 전달 모드로 사용하는 첫 번째 채널의 관류 속도를 설정하고 관류 속도를 분당 1밀리리터로 설정하여 장치 설정에 따라 흐름 방향이 올바른지 확인합니다. 연동 펌프를 보정하여 입구 라인을 통해 전달되거나 출구 라인에서 가져온 유체의 양이 둘 사이에서 일관되게 흐르도록 하여 튜브 ID가 1.85mm로 설정되도록 합니다.
키패드의 전원 버튼을 눌러 입구 및 출구 라인 모두에 대해 분당 1밀리리터의 기계 관류를 통해 탈세포화를 시작합니다. 흐름이 입구 및 출구 라인 모두에서 진행 중인지 모니터링하고 확인합니다. 1 리터의 0.25 % STS를 사용하여 필요에 따라 보충 포트를 통해 생물 반응기 저장소를 보충합니다.
그런 다음 5 일째에 나타날 조직의 흰색 반투명 모양을 찾아 쥐 뒷다리의 탈 세포화를 나타냅니다. 탈세포화를 확인한 후 세제 저장소를 PBS 및 1%항생제-항진균제 저장소로 교체하고 플라스크의 입구를 파라필름으로 밀봉합니다. 분당 1 밀리리터로 PBS와 1 % 항생제-항진균제 관류를 시작하고 이틀 동안 계속하십시오.
PBS와 1 % 항생제-항진균제 저장소를 200 밀리리터의 0.1 % 기생산, 4 % 에탄올 저장소로 교체하고 2 시간 동안 분당 1 밀리리터로 관류를 시작하십시오. 생물 안전 캐비닛 아래에서 두 쌍의 멸균 Adson 겸자와 한 쌍의 집게를 사용하여 입구 라인을 비틀고 다른 한 쌍의 집게가 캐뉼러를 잡고 캐뉼러가 탈환 현상을 방지하기 위해 당겨지지 않도록하여 입구 라인에서 뒷다리를 분리합니다. 팔다리를 PBS가 들어있는 500 밀리리터 유리 병에 보관하고 추가 사용 될 때까지 섭씨 4도에서 1 % 항생제-항진균제를 보관하십시오.
탈세포화된 대퇴 동맥과 정맥 모두 모든 층과 주변 결합 조직에서 핵 함량의 손실을 나타냈는데, 이는 천연 혈관에 존재하는 청색 염색 핵이 없기 때문입니다. 대퇴 정맥과 동맥의 망막 및 외막은 탈세포화된 혈관에서 유지되었습니다. 대퇴 신경은 내신경을 포함한 조직 구조의 보존을 보였다.
뼈는 골세포의 염색된 핵의 손실과 탈세포화 후 주변 내막 및 골막 층에서 전반적인 구조적 유지를 보였습니다. 피부는 표피와 진피에서 세포의 손실을 보였다. 진피는 천연 피부 조직과 유사한 콜라겐 섬유가 유지되는 것으로 나타났습니다.
마지막으로, 골격근의 횡단면도는 endomysium의 주변에 위치한 핵의 손실을 보여주었습니다. 근원섬유 함량은 탈세포화 후 각각의 근막 내에서 유지되었습니다. PicoGreen을 사용한 DNA 정량화도 수행되었으며, 여기서 대퇴 혈관, 신경, 피부, 근육 및 뼈에 걸쳐 DNA 함량이 크게 감소했습니다.
이 프로토콜에 따라, 탈세포화된 사지를 추가로 특성화할 수 있다. 여기에는 조직 학적 및 생화학 적 방법을 사용하여 세포 외 기질을 검사하고 이미징을 사용하여 혈관을 평가하는 것이 포함됩니다. 탈세포화된 줄기는 또한 조직-특이적 세포를 사용하여 재세포화될 수 있다.
