Protokolümüz, uyanık farelerde mikroglia dinamiklerinin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesini sağlar. Mikroglia'nın sürveyans davranışını veya nöronlarla etkileşimini araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir. Bu yöntemin avantajı, hareket artefaktının sağlam kafa fiksasyonu nedeniyle görüntüleme verilerini kolayca kirletmemesidir.
Ayrıca, yüksek kare hızında görüntülemeden sonra restorasyon, verilerden hareket artefaktını ortadan kaldırmamızı sağlar. Bu yöntemde AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonunun cerrahisi teknik olarak zordur. Başarısızlık başlangıçta yaygındır, bu yüzden lütfen hayal kırıklığına uğramayın ve daha fazla pratik yapın.
Enjeksiyon aparatını hazırlamak için, stereotaksik bir aletin pipet tutucusuna bir tüp içinden 26 gauge Hamilton şırıngasına bağlı bir cam pipet yerleştirin. Ardından, pipet tutucuyu dikey eksenden 60 derece öne doğru eğin. Cam pipeti, şırıngayı ve bağlantı borusunu sıvı parafin ile doldurun ve şırıngayı bir mikroenjektöre yerleştirin.
Anestezi uygulanan fareye analjezi uygulayın ve yardımcı kulak çubuklarını takın. Ardından, hayvanı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik alete sabitleyin. Saçları cerrahi bölgeden çıkardıktan ve cerrahi alanı dezenfekte ettikten sonra, kafa derisinde orta hat boyunca iki santimetre uzunluğunda bir kesi yapın ve kafatasının sağ birincil görsel korteksin üzerinde iyi bir şekilde pozlanmasını sağlayın.
Açıkta kalan kafatasındaki periosteumu çıkarmak için forseps kullanın. Yaklaşık 0,5 milimetre çapında küçük bir delik oluşturmak için kafatasını stereotaksik koordinatlarda orta hatta üç milimetre yanal ve lambda hattının 5 mililitre önünde delin. Ardından, farenin açıkta kalan kafatasına yaklaşık iki santimetre x iki santimetre arasında bir şeffaf film parçası yerleştirin.
Bir pipetleyici kullanarak film üzerindeki bir mikrolitre AAV çözelti damlacığını dışarı atın. Şırıngayı ilerletin. Ve film üzerindeki AAV çözeltisinin damlacığına bir cam pipet ucu yerleştirin ve AAV çözeltisini aspire etmek için şırıngayı yavaşça çekin.
Ardından, cam pipeti kafatasında oluşturulan delikten beyin yüzeyinden 500 mikrometre derinliğe yerleştirin. Daha sonra, mikroenjektörü kullanarak saatte iki mikrolitrelik bir enjeksiyon hacmi akış hızında 0,5 mikrolitre AAV çözeltisi enjekte edin. İğneyi geri çekin ve beyin yüzeyini salinle durulayın.
Delerek kafatası üzerindeki işaret boyunca dairesel bir oluk oluşturun. Kafatasının görünürlüğünü sağlamak için kalıntıları temizleyin ve delme sırasında ısınmayı önlemek için tuzlu su uygulayın. Merkezi kafatasına forseps ile hafifçe bastırın.
Delme derinliği, çok az dirençle dikey olarak hareket ederse yeterlidir. Oluk yeterli derinliğe ulaştığında, forsepsin ucunu merkezi kafatası parçasının dibine yerleştirin. Beyin yüzeyini açığa çıkarmak için yavaşça kaldırın ve çıkarın.
27 gauge'lik bir iğne kullanarak, açıkta kalan beyin yüzeyinin kenarındaki durayı delin ve yırtın. Forsepsin ucunu duranın kenarında yapılan delikten geçirin ve beyin yüzeyini açığa çıkarmak için soyun. Hemostatik lifleri tuzlu su içinde birer birer dağıttıktan sonra, hemostatik lifleri transekte duranın bulunduğu deliğin kenarları boyunca yerleştirin.
Kraniyal pencereyi açıkta kalan beyin yüzeyine yerleştirin ve ardından pencereye hafifçe bastırırken anında yapıştırıcı ile kafatasına yapıştırın. Daha sonra, tüm açıkta kalan kafatasına anında yapıştırıcı uygulayın. Ardından, kafatası penceresini kafa plakasının kare deliğinin ortasına yerleştirmek için kafatasına dikkatlice bir kafa plakası takın.
Tutkal yeterince sertleştikten sonra, kafa ve kafa bıçağı arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için açıkta kalan kafatasına diş çimentosu uygulayın. Özel yapım gölgelendirme cihazını ve görsel stimülasyon için bir LCD monitörü kurmak için, önce lensi beyin yüzeyine odaklanacak şekilde konumlandırın ve ardından bu lens konumunu orijinal Z konumu olarak ayarlayın. XY koordinatlarını sabit tutun ve objektif lensi yükseltin.
Fareyi ve stereotaksik aleti objektif lensten çıkarın. Silikon kullanarak kafa plakasının üstüne bir gölgelendirme cihazı takın ve kafa plakası ile gölgelendirme cihazı arasındaki boşluğun iyi kapatıldığından emin olun. Gölgelendirme cihazını damıtılmış suyla doldurun.
Ardından, fareyi objektif lensin altındaki stereotaksik çerçeveyle sabitleyin. Objektif lensin derinliğini kontrol ederek beyin yüzeyindeki odak düzlemini dikkatlice sıfırlayın. LCD monitörden kaynaklanan ışık kirliliğini önlemek için objektif lensi siyah alüminyum folyo ile örtün.
Görsel uyaranları sunmak için farenin gözlerinin önünde 12,5 santimetre değerinde 10 inçlik bir LCD monitör ayarlayın. EGFP ve R-CaMP için floresan gönderme toplama filtrelerini ve uyarma dalga boyunu 1.000 nanometre olarak yapılandırın. Piksel başına 0,25 mikron uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler elde edin.
R-CaMP pozitif nöronların ve EGFP-pozitif mikroglia'nın aynı anda görüntülenebileceği görüntüleme bölgesini bulun. Katman 2, 3'te. 30 hertz kare hızında görüntüler elde edin.
Görüntü yakalama ile eşzamanlı olarak, fareye altı yönde 12 yönde, 30 derecelik adımlarla sıfırdan 150 dereceye kadar sürüklenen ızgara görsel uyaranları sunun. Görüntü alımından sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın. Gölgelendirme cihazını ve stereotaksik cihazı fareden ayırın ve fareyi ev kafesine geri getirin.
Bu protokol kullanılarak, sekiz haftalık transgenik bir farenin birincil görsel korteksinde AAV enjeksiyonu ve kraniyal pencere implantasyonu, ardından katman 2, 3'te R-CaMP tabanlı nöral aktivite ve mikroglial dinamiklerin iki foton görüntülemesi yapıldı. Izgara görsel uyaranları fareye sunuldu ve adendritik omurgadaki görsel yanıtlar kalsiyum izleri kullanılarak analiz edildi. Mikroglial süreçler hızlı dinamikler gösterdi ve morfolojilerini 10 saniye içinde değiştirdi.
12 haftalık transgenik bir farede birincil görsel korteksin 3. katman 2'sinde iki fotonlu görüntüleme kullanılarak, R-CaMP, burada macentada görülen nöronlarda gözlendi. Yeşil renkte görülen mikrogliada bir EGFP gözlendi. EGFP ve R-CaMP için bireysel sinyaller de gözlendi.
Başarılı AAV enjeksiyonu bu yöntem için kritik öneme sahiptir. AAV enjeksiyonunun başarısız olmasının başlıca nedenleri saat camı pipetleri ve doku hasarıdır. Mikroglia üzerindeki sürveyans davranışı ve SNAP'in mikroglia etkileşiminin, Alzheimer hastalığı gibi çeşitli patojenik mekanizmalarda yaygın olduğu tespit edilmiştir.
Yöntemimiz bu alana odaklanan araştırmalara faydalıdır.
