Notre protocole permet l’imagerie simultanée de la dynamique de la microglie et de l’activité neuronale chez la souris éveillée. Il peut être largement appliqué pour étudier le comportement de surveillance de la microglie ou l’interaction avec les neurones. L’avantage de cette méthode est que les artefacts de mouvement ne contaminent pas facilement les données d’imagerie en raison de la fixation robuste de la tête.
De plus, la restauration après l’imagerie à la fréquence d’images élevée nous permet d’éliminer l’artefact de mouvement des données. Dans cette méthode, l’injection d’AAV et la chirurgie d’implantation de fenêtre crânienne sont techniquement exigeantes. L’échec est courant au début, alors s’il vous plaît ne soyez pas frustré et pratiquez plus.
Pour préparer l’appareil d’injection, placer une pipette en verre reliée à une seringue Hamilton de calibre 26 à travers un tube sur un porte-pipette d’un instrument stéréotaxique. Ensuite, inclinez le support de pipette de 60 degrés avant l’axe vertical. Remplissez la pipette en verre, la seringue et le tube de raccordement avec de la paraffine liquide et placez la seringue sur un micro-injecteur.
Administrer l’analgésie à la souris anesthésiée et fixer les barres d’oreille auxiliaires. Ensuite, fixez l’animal sur l’instrument stéréotaxique avec sa face dorsale vers le haut. Après avoir retiré les cheveux du site chirurgical et désinfecté la zone chirurgicale, faites une incision de deux centimètres de long sur le cuir chevelu le long de la ligne médiane, assurant une bonne exposition du crâne au-dessus du cortex visuel primaire droit.
Utilisez une pince pour enlever le périoste sur le crâne exposé. Percez le crâne sur les coordonnées stéréotaxiques trois millimètres latéralement à la ligne médiane et 5 millilitres avant la ligne lambda pour créer un petit trou d’un diamètre d’environ 0,5 millimètres. Ensuite, placez un morceau de film transparent d’environ deux centimètres sur deux centimètres sur le crâne exposé de la souris.
Expulser un microlitre de gouttelette de solution AAV sur le film à l’aide d’un pipetter. Avancez la seringue. Placez une pointe de pipette en verre dans la gouttelette de solution AAV sur le film et tirez doucement la seringue pour aspirer la solution AAV.
Ensuite, insérez la pipette en verre à une profondeur de 500 micromètres de la surface du cerveau à travers le trou créé dans le crâne. Ensuite, injectez 0,5 microlitre de solution AAV à l’aide du micro-injecteur à un débit volumique d’injection de deux microlitres par heure. Retirez l’aiguille et rincez la surface du cerveau avec une solution saline.
Créez une rainure circulaire le long de la marque sur le crâne en perçant. Nettoyez les débris pour assurer la visibilité du crâne et appliquez une solution saline pour éviter l’échauffement pendant le forage. Appuyez doucement sur le crâne central avec une pince.
La profondeur de forage est suffisante s’il se déplace verticalement avec peu de résistance. Lorsque la rainure atteint suffisamment de profondeur, insérez la pointe de la pince dans le bas du fragment de crâne central. Soulevez-le doucement et retirez-le pour exposer la surface du cerveau.
À l’aide d’une aiguille de calibre 27, piquez et déchirez la dure-mère au bord de la surface exposée du cerveau. Insérez l’extrémité de la pince à travers le trou fait au bord de la dure-mère et décollez-la pour exposer la surface du cerveau. Après avoir dispersé les fibres hémostatiques une par une dans une solution saline, placez les fibres hémostatiques le long des bords du trou dans lequel la dure-mère transectée est présente.
Placez la fenêtre crânienne sur la surface exposée du cerveau, puis collez-la au crâne avec de la colle instantanée tout en appuyant doucement sur la fenêtre. Ensuite, appliquez de la colle instantanée sur tout le crâne exposé. Ensuite, attachez soigneusement une plaque de tête sur le crâne pour localiser la fenêtre crânienne au centre du trou carré de la plaque de tête.
Une fois que la colle a suffisamment durci, appliquez du ciment dentaire sur le crâne exposé pour renforcer la fixation entre la tête et la lame de tête. Pour installer le dispositif d’ombrage sur mesure et un moniteur LCD pour la stimulation visuelle, positionnez d’abord la lentille pour qu’elle se concentre sur la surface du cerveau, puis définissez cette position de lentille sur la position Z d’origine. Gardez les coordonnées XY constantes et élevez l’objectif de l’objectif.
Retirez la souris et l’instrument stéréotaxique de l’objectif. Fixez un dispositif d’ombrage sur le dessus de la plaque de tête en silicone, en veillant à ce que l’espace entre la plaque de tête et le dispositif d’ombrage soit bien scellé. Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau distillée.
Ensuite, fixez la souris avec le cadre stéréotaxique sous l’objectif objectif. Réinitialisez soigneusement le plan focal à la surface du cerveau, en vérifiant la profondeur de la lentille de l’objectif. Couvrez l’objectif avec du papier d’aluminium noir pour éviter la contamination lumineuse du moniteur LCD.
Réglez un moniteur LCD de 10 pouces à 12,5 centimètres devant les yeux de la souris pour présenter des stimuli visuels. Configurez les filtres de collecte de soumission fluorescente pour EGFP et R-CaMP et la longueur d’onde d’excitation à 1 000 nanomètres. Acquérir des images avec une résolution spatiale de 0,25 micron par pixel.
Trouvez la région d’imagerie où les neurones R-CaMP-positifs et la microglie EGFP-positive peuvent être imagés simultanément. Dans la couche 2, 3. Acquérir des images à la fréquence d’images de 30 hertz.
Simultanément à l’acquisition de l’image, présentez des stimuli visuels à la souris dans 12 directions à six orientations, de zéro à 150 degrés par pas de 30 degrés. Après l’acquisition de l’image, retirez la souris de l’étape du microscope. Détachez le dispositif d’ombrage et l’instrument stéréotaxique de la souris et remettez la souris dans sa cage d’origine.
En utilisant ce protocole, l’injection d’AAV et l’implantation de la fenêtre crânienne ont été effectuées dans le cortex visuel primaire d’une souris transgénique âgée de huit semaines, suivies de deux images photoniques de l’activité neuronale basée sur R-CaMP et de la dynamique microgliale dans les couches 2, 3. Des stimuli visuels râpés ont été présentés à la souris et les réponses visuelles dans la colonne vertébrale adendritique ont été analysées à l’aide de traces de calcium. Les processus microgliaux ont montré une dynamique rapide et ont changé leur morphologie en 10 secondes.
En utilisant l’imagerie à deux photons dans la couche 2, 3 du cortex visuel primaire chez une souris transgénique âgée de 12 semaines, R-CaMP a été observé dans les neurones, vu ici en magenta. Un EGFP a été observé dans la microglie, vu en vert. Des signaux individuels ont également été observés pour l’EGFP et le R-CaMP.
Une injection réussie d’AAV est essentielle pour cette méthode. Les principales raisons de l’échec de l’injection d’AAV sont les pipettes en verre de l’horloge et les lésions tissulaires. Le comportement de surveillance sur la microglie et l’interaction microgliale du SNAP ont été identifiés comme étant répandus dans divers mécanismes pathogènes, comme la maladie d’Alzheimer.
Notre méthode est bénéfique pour la recherche axée sur ce domaine.
