הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לחקור את התנהגות המעקב של מיקרוגליה או את האינטראקציה עם נוירונים. היתרון של שיטה זו הוא כי חפצי תנועה אינם מזהמים בקלות נתוני הדמיה בגלל קיבוע ראש חזק.
כמו כן, שחזור לאחר הדמיה בקצב פריימים גבוה מאפשר לנו לחסל חפץ תנועה מהנתונים. בשיטה זו, הזרקת AAV וניתוח השתלת חלון גולגולתי הם תובעניים מבחינה טכנית. כישלון נפוץ בהתחלה, אז בבקשה אל תהיו מתוסכלים ותתאמנו יותר.
כדי להכין את מכשיר ההזרקה, הניחו פיפטה מזכוכית המחוברת למזרק המילטון בעל 26 מד דרך צינור על מחזיק פיפטה של מכשיר סטריאוטקסי. לאחר מכן, הטה את מחזיק פיפטה 60 מעלות קדימה מן הציר האנכי. ממלאים את פיפטת הזכוכית, את המזרק ואת צינור החיבור בפרפין נוזלי ומניחים את המזרק על מיקרו-מזרק.
לנהל שיכוך כאבים לעכבר מורדם ולחבר את מוטות האוזן עזר. לאחר מכן, תקן את החיה על המכשיר הסטריאוטקסי עם הצד הגבי שלה כלפי מעלה. לאחר הסרת שיער מאתר הניתוח וחיטוי אזור הניתוח, בצעו חתך באורך שני סנטימטרים בקרקפת לאורך קו האמצע, מה שמבטיח חשיפה טובה של הגולגולת מעל קליפת המוח הראייתית הראשונית הימנית.
השתמש במלקחיים כדי להסיר את periosteum על הגולגולת החשופה. קדח את הגולגולת על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות שלושה מילימטרים לרוחב לקו האמצע ו -5 מיליליטר קדמי לקו הלמדא כדי ליצור חור קטן בקוטר של כ -0.5 מילימטרים. לאחר מכן, הניחו פיסת סרט שקוף בגודל של כשני סנטימטרים על שני סנטימטרים על גולגולתו החשופה של העכבר.
להוציא מיקרוליטר אחד של טיפת תמיסת AAV על הסרט באמצעות פיטר. מקדמים את המזרק. ומניחים קצה פיפטה מזכוכית לתוך טיפת תמיסת AAV על הסרט ומושכים בעדינות את המזרק כדי לשאוף את תמיסת ה- AAV.
לאחר מכן, הכנס את פיפטת הזכוכית לעומק של 500 מיקרומטר מפני השטח של המוח דרך החור שנוצר בגולגולת. לאחר מכן, הזריקו 0.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV באמצעות המיקרו-מזרק בקצב זרימה של נפח הזרקה של שני מיקרוליטרים לשעה. למשוך את המחט ולשטוף את פני המוח עם מלוחים.
צור חריץ עגול לאורך הסימן על הגולגולת על ידי קידוח. נקו את הלכלוך כדי להבטיח ראות של הגולגולת ומרחו מי מלח למניעת חימום במהלך הקידוח. לחץ בעדינות על הגולגולת המרכזית עם מלקחיים.
עומק הקידוח מספיק אם הוא נע אנכית עם התנגדות מועטה. כאשר החריץ מגיע לעומק מספיק, הכנס את קצה המלקחיים לתחתית שבר הגולגולת המרכזי. הרימו והסירו אותו בעדינות כדי לחשוף את פני השטח של המוח.
באמצעות מחט של 27 מד, דוקרים וקורעים את הדורה בקצה משטח המוח החשוף. הכניסו את קצה המלקחיים דרך החור שנוצר בקצה הדורה וקילפו אותו כדי לחשוף את פני השטח של המוח. לאחר פיזור סיבים המוסטטיים בזה אחר זה במי מלח, מניחים את הסיבים ההמוסטטיים לאורך שולי החור שבו נמצאת הדורה הטרנסקטית.
הניחו את חלון הגולגולת על משטח המוח החשוף ולאחר מכן הדביקו אותו לגולגולת עם דבק מיידי תוך לחיצה עדינה על החלון. לאחר מכן, מרחו דבק מיידי על כל הגולגולת החשופה. לאחר מכן, חברו בזהירות לוחית ראש לגולגולת כדי לאתר את חלון הגולגולת במרכז החור המרובע של לוחית הראש.
לאחר שהדבק התקשה מספיק, מרחו מלט דנטלי על הגולגולת החשופה כדי לחזק את החיבור בין הראש ללהב הראש. כדי להתקין את התקן ההצללה בהתאמה אישית וצג LCD לגירוי חזותי, מקם תחילה את העדשה כך שתתמקד על פני השטח של המוח ולאחר מכן הגדר מיקום עדשה זה כמיקום Z המקורי. שמור על קואורדינטות XY קבועות והרם את עדשת המטרה.
הסר את העכבר ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעדשה האובייקטיבית. חברו מכשיר הצללה בחלק העליון של לוחית הראש באמצעות סיליקון, וודאו שהרווח בין לוחית הראש למכשיר ההצללה אטום היטב. מלאו את מכשיר ההצללה במים מזוקקים.
לאחר מכן, תקן את העכבר עם המסגרת הסטריאוטקסית מתחת לעדשה האובייקטיבית. אפסו בזהירות את מישור המוקד על פני המוח, בדקו את עומק עדשת המטרה. כסה את עדשת האובייקט ברדיד אלומיניום שחור כדי למנוע זיהום אור מצג ה- LCD.
הגדר צג LCD בגודל 10 אינץ' בגודל 12.5 ס"מ מול עיני העכבר כדי להציג גירויים חזותיים. הגדר את מסנני איסוף ההגשה הפלואורסצנטיים עבור EGFP ו- R-CaMP ואת אורך גל העירור ל- 1, 000 ננומטר. קבל תמונות ברזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרון לפיקסל.
מצא את אזור ההדמיה שבו נוירונים חיוביים R-CaMP ומיקרוגליה חיובית EGFP ניתן לצלם בו זמנית. בשכבה 2, 3. רכוש תמונות בקצב מסגרות של 30 הרץ.
במקביל לרכישת התמונה, הציגו גירויים חזותיים נודדים לעכבר ב-12 כיוונים בשישה כיוונים, מאפס ל-150 מעלות בצעדים של 30 מעלות. לאחר רכישת התמונה, הסר את העכבר משלב המיקרוסקופ. נתקו את מכשיר ההצללה ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעכבר, והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.
באמצעות פרוטוקול זה, הזרקת AAV והשתלת חלון גולגולתי בוצעו בקליפת המוח הראייתית העיקרית של עכבר מהונדס בן שמונה שבועות, ולאחר מכן שני דימות פוטונים של פעילות עצבית מבוססת R-CaMP ודינמיקה מיקרוגליאלית בשכבה 2, 3. גירויים חזותיים מגרגרים הוצגו לעכבר והתגובות החזותיות בעמוד השדרה האדנדריטי נותחו באמצעות עקבות סידן. תהליכי מיקרוגליאה הראו דינמיקה מהירה ושינו את המורפולוגיה שלהם תוך 10 שניות.
באמצעות דימות של שני פוטונים בשכבה 2, 3 של קליפת המוח הראייתית הראשונית בעכבר מהונדס בן 12 שבועות, R-CaMP נצפה בנוירונים, שנראה כאן במגנטה. EGFP נצפה במיקרוגליה, נראה בירוק. אותות בודדים נצפו גם עבור EGFP ו- R-CaMP.
הזרקת AAV מוצלחת היא קריטית לשיטה זו. הסיבות העיקריות להזרקת AAV כושלת הן פיפטות זכוכית השעון והנזק לרקמות. התנהגות המעקב אחר תאי מיקרוגליה והאינטראקציה של תאי המיקרוגליה של סנאפ זוהו כנפוצים במנגנונים פתוגניים שונים, כמו מחלת אלצהיימר.
השיטה שלנו מועילה למחקר המתמקד בתחום זה.
