Nosso protocolo permite a obtenção simultânea de imagens da dinâmica da micróglia e da atividade neuronal em camundongos acordados. Pode ser amplamente aplicado para investigar o comportamento de vigilância da micróglia ou a interação com neurônios. A vantagem desse método é que os artefatos de movimento não contaminam facilmente os dados de imagem devido à fixação robusta da cabeça.
Além disso, a restauração após a geração de imagens na alta taxa de quadros nos permite eliminar o artefato de movimento dos dados. Neste método, a injeção de AAV e a cirurgia de implante de janela craniana são tecnicamente exigentes. O fracasso é comum no início, então por favor, não se frustre e pratique mais.
Para preparar o aparelho de injeção, coloque uma pipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton de calibre 26 através de um tubo em um suporte de pipeta de um instrumento estereotáxico. Em seguida, incline o suporte da pipeta 60 graus anteriormente a partir do eixo vertical. Encha a pipeta de vidro, a seringa e o tubo de ligação com parafina líquida e coloque a seringa num microinjetor.
Administrar analgesia no camundongo anestesiado e fixar as barras auxiliares da orelha. Em seguida, fixe o animal no instrumento estereotáxico com o dorsal para cima. Após retirar os cabelos do local cirúrgico e desinfetar a área cirúrgica, faça uma incisão de dois centímetros de comprimento no couro cabeludo ao longo da linha média, garantindo uma boa exposição do crânio acima do córtex visual primário direito.
Use pinça para remover o periósteo do crânio exposto. Perfure o crânio nas coordenadas estereotáxicas três milímetros laterais à linha média e 5 mililitros anteriores à linha lambda para criar um pequeno orifício com um diâmetro de aproximadamente 0,5 milímetros. Em seguida, coloque um pedaço de filme transparente de aproximadamente dois centímetros por dois centímetros sobre o crânio exposto do rato.
Expulse uma gota de solução de AAV um microlitro sobre o filme usando um pipetador. Avançar a seringa. E coloque uma ponta de pipeta de vidro na gota da solução de AAV sobre o filme e puxe suavemente a seringa para aspirar a solução de AAV.
Em seguida, insira a pipeta de vidro a uma profundidade de 500 micrômetros da superfície do cérebro através do orifício criado no crânio. Em seguida, injetar 0,5 microlitros de solução de AAV usando o microinjetor a uma vazão volumétrica de injeção de dois microlitros por hora. Retire a agulha e lave a superfície cerebral com soro fisiológico.
Crie um sulco circular ao longo da marca no crânio perfurando. Limpe os detritos para garantir a visibilidade do crânio e aplique soro fisiológico para evitar o aquecimento durante a perfuração. Pressione suavemente o crânio central com pinças.
A profundidade de perfuração é suficiente se ela se move verticalmente com pouca resistência. Quando o sulco atingir profundidade suficiente, insira a ponta da pinça na parte inferior do fragmento central do crânio. Levante e remova suavemente para expor a superfície cerebral.
Usando uma agulha de calibre 27, pice e rasgue a dura-máter na borda da superfície cerebral exposta. Insira a ponta da pinça através do orifício feito na borda da dura-máter e descasque-a para expor a superfície cerebral. Após dispersar as fibras hemostáticas, uma a uma, em solução salina, colocar as fibras hemostáticas ao longo das margens do orifício em que a dura-máter transeccionada está presente.
Coloque a janela craniana na superfície exposta do cérebro e, em seguida, cole-a ao crânio com cola instantânea enquanto pressiona suavemente a janela. Depois, aplique cola instantânea em todo o crânio exposto. Em seguida, prenda cuidadosamente uma placa da cabeça no crânio para localizar a janela craniana no centro do orifício quadrado da placa da cabeça.
Uma vez que a cola tenha endurecido suficientemente, aplique cimento dental no crânio exposto para reforçar a fixação entre a cabeça e a lâmina da cabeça. Para instalar o dispositivo de sombreamento personalizado e um monitor LCD para estimulação visual, primeiro posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas XY constantes e eleve a lente objetiva.
Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva. Fixe um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa principal usando silicone, garantindo que o espaço entre a placa da cabeça e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado. Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada.
Em seguida, fixe o mouse com a armação estereotáxica sob a lente objetiva. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva. Cubra a lente objetiva com papel alumínio preto para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD.
Defina um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 centímetros na frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais. Configure os filtros de coleta de submissão fluorescente para EGFP e R-CaMP e o comprimento de onda de excitação para 1.000 nanômetros. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 mícrons por pixel.
Encontre a região de imagem onde os neurônios R-CaMP-positivos e a microglia EGFP-positiva podem ser fotografados simultaneamente. Na camada 2, 3. Adquira imagens na taxa de quadros de 30 hertz.
Simultaneamente à aquisição da imagem, apresentar estímulos visuais de grade de deriva para o mouse em 12 direções em seis orientações, de zero a 150 graus em passos de 30 graus. Após a aquisição da imagem, retirar o camundongo do estágio do microscópio. Retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e devolva o mouse à sua gaiola inicial.
Usando este protocolo, a injeção de AAV e o implante da janela craniana foram realizados no córtex visual primário de um camundongo transgênico de oito semanas de idade, seguido por duas imagens de fótons da atividade neural baseada em R-CaMP e dinâmica microglial nas camadas 2, 3. Estímulos visuais de grade foram apresentados ao camundongo e as respostas visuais na coluna adendrítica foram analisadas usando traços de cálcio. Os processos microgliais apresentaram dinâmica rápida e mudaram sua morfologia em 10 segundos.
Usando imagens de dois fótons na camada 2, 3 do córtex visual primário em um camundongo transgênico de 12 semanas de idade, R-CaMP foi observado em neurônios, visto aqui em magenta. Um EGFP foi observado na micróglia, visto em verde. Sinais individuais também foram observados para EGFP e R-CaMP.
A injeção bem-sucedida de AAV é fundamental para este método. As principais razões para a falha na injeção de AAV são as pipetas de vidro relógio e o dano tecidual. O comportamento de vigilância na microglia e a interação da microglia do SNAP foram identificados como prevalentes em vários mecanismos patogênicos, como a doença de Alzheimer.
Nosso método é benéfico para as pesquisas voltadas para este campo.
