우리의 프로토콜은 깨어 있는 생쥐에서 미세아교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 가능하게 합니다. 미세아교세포의 감시 거동 또는 뉴런과의 상호 작용을 조사하는 데 널리 적용될 수 있습니다. 이 방법의 장점은 모션 아티팩트가 견고한 헤드 고정으로 인해 이미징 데이터를 쉽게 오염시키지 않는다는 것입니다.
또한 높은 프레임 속도로 이미징 후 복원하면 데이터에서 모션 아티팩트를 제거할 수 있습니다. 이 방법에서 AAV 주사와 두개골 창 이식 수술은 기술적으로 까다롭습니다. 처음에는 실패가 많기 때문에 좌절하지 말고 더 연습하십시오.
주입 장치를 준비하려면 튜브를 통해 26게이지 해밀턴 주사기에 연결된 유리 피펫을 정위 기구의 피펫 홀더에 놓습니다. 그런 다음 피펫 홀더를 세로축에서 앞쪽으로 60도 기울입니다. 유리 피펫, 주사기 및 연결 튜브에 액체 파라핀을 채우고 주사기를 미세 주입기에 놓습니다.
마취된 마우스에 진통제를 투여하고 보조 이어바를 부착합니다. 그런 다음 동물을 등쪽이 위로 향하게 하여 정위 기구에 고정합니다. 수술 부위에서 모발을 제거하고 수술 부위를 소독 한 후 정중선을 따라 두피를 2cm 길이로 절개하여 오른쪽 일차 시각 피질 위의 두개골이 잘 노출되도록합니다.
집게를 사용하여 노출 된 두개골의 골막을 제거하십시오. 정중선에서 측면으로 3mm, 람다 선에서 앞쪽으로 5 밀리리터의 입위 좌표에 두개골을 뚫어 직경이 약 0.5 밀리미터 인 작은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 마우스의 노출 된 두개골에 약 2cm x 2cm 크기의 투명 필름 조각을 놓습니다.
피펫터를 사용하여 필름에 1 마이크로 리터의 AAV 용액 방울을 배출합니다. 주사기를 전진시킵니다. 그리고 유리 피펫 팁을 필름의 AAV 용액 방울에 넣고 주사기를 부드럽게 당겨 AAV 용액을 흡인합니다.
다음으로, 두개골에 생성 된 구멍을 통해 뇌 표면에서 500 마이크로 미터 깊이까지 유리 피펫을 삽입하십시오. 그런 다음 마이크로 인젝터를 사용하여 시간당 2 마이크로 리터의 주입 부피 유량으로 0.5 마이크로 리터의 AAV 용액을 주입합니다. 바늘을 빼고 식염수로 뇌 표면을 헹굽니다.
드릴링하여 두개골의 표시를 따라 원형 홈을 만듭니다. 두개골의 가시성을 보장하기 위해 파편을 청소하고 드릴링 중 가열을 방지하기 위해 식염수를 바르십시오. 집게로 중앙 두개골을 부드럽게 누릅니다.
드릴링 깊이는 저항이 거의 없이 수직으로 움직이면 충분합니다. 홈이 충분한 깊이에 도달하면 집게의 끝을 중앙 두개골 조각의 바닥에 삽입하십시오. 부드럽게 들어 올려 제거하여 뇌 표면을 노출시킵니다.
27 게이지 바늘을 사용하여 노출 된 뇌 표면의 가장자리에서 경막을 찔러 찢습니다. 경막 가장자리에 생긴 구멍에 집게의 끝을 삽입하고 떼어내면 뇌 표면이 드러납니다. 지혈 섬유를 식염수에 하나씩 분산시킨 후, transected dura가 존재하는 구멍의 가장자리를 따라 지혈 섬유를 놓습니다.
노출된 뇌 표면에 두개골 창을 놓고 창을 부드럽게 누르면서 순간 접착제로 두개골에 부착합니다. 그런 다음 노출된 두개골 전체에 순간 접착제를 바릅니다. 그런 다음 두개골에 헤드 플레이트를 조심스럽게 부착하여 헤드 플레이트의 사각형 구멍 중앙에 두개골 창을 찾습니다.
접착제가 충분히 굳으면 노출된 두개골에 치과용 시멘트를 바르고 머리와 머리 칼날 사이의 부착물을 강화합니다. 맞춤형 음영 장치와 시각 자극을 위한 LCD 모니터를 설치하려면 먼저 렌즈를 뇌 표면에 초점을 맞춘 다음 이 렌즈 위치를 원래 Z 위치로 설정합니다. XY 좌표를 일정하게 유지하고 대물 렌즈를 높입니다.
대물 렌즈에서 마우스와 정위 기구를 제거합니다. 실리콘을 사용하여 헤드 플레이트 상단에 음영 장치를 부착하여 헤드 플레이트와 음영 장치 사이의 공간이 잘 밀봉되었는지 확인합니다. 차광 장치를 증류수로 채 웁니다.
그런 다음 대물 렌즈 아래에 정체 프레임이 있는 마우스를 고정합니다. 뇌 표면의 초점면을 조심스럽게 재설정하여 대물 렌즈의 깊이를 확인하십시오. LCD 모니터의 빛 오염을 방지하기 위해 대물 렌즈를 검은색 알루미늄 호일로 덮습니다.
10인치 LCD 모니터를 마우스 눈 앞 12.5cm로 설정하여 시각적 자극을 줍니다. EGFP 및 R-CaMP에 대한 형광 제출 수집 필터와 여기 파장을 1, 000 나노미터로 구성합니다. 픽셀당 0.25미크론의 공간 해상도로 이미지를 수집합니다.
R-CaMP 양성 뉴런과 EGFP 양성 미세아교세포를 동시에 이미징할 수 있는 이미징 영역을 찾습니다. 레이어 2, 3에서. 30Hz의 프레임 속도로 이미지를 수집합니다.
이미지 획득과 동시에 0도에서 150도까지 30도 단계로 6개 방향에서 12방향으로 드리프트 격자 시각적 자극을 마우스에 제공합니다. 이미지 획득 후 현미경 단계에서 마우스를 제거합니다. 마우스에서 음영 장치와 정체 기기를 분리하고 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
이 프로토콜을 사용하여 8주 된 형질전환 마우스의 일차 시각 피질에서 AAV 주사 및 두개골 창 이식을 수행한 후 R-CaMP 기반 신경 활동 및 소교세포 역학의 2개 광자 이미징을 층 2, 3에서 수행했습니다. 격자 시각적 자극을 마우스에 제시하고 수지상 척추의 시각적 반응을 칼슘 미량을 사용하여 분석했습니다. 미세아교세포과정은 빠른 역동성을 보였고 10초 이내에 형태를 변화시켰다.
12주 된 형질전환 마우스에서 일차 시각 피질의 층 2, 3에 있는 이광자 이미징을 사용하여 R-CaMP가 뉴런에서 관찰되었으며, 여기에서 자홍색으로 볼 수 있습니다. EGFP는 녹색으로 보이는 미세아교세포에서 관찰되었습니다. EGFP 및 R-CaMP에 대한 개별 신호도 관찰되었습니다.
이 방법에는 성공적인 AAV 주입이 중요합니다. AAV 주입 실패의 주요 원인은 시계 유리 피펫과 조직 손상입니다. 미세아교세포에 대한 감시 행동과 SNAP의 미세아교세포 상호작용은 알츠하이머병과 같은 다양한 병원성 기전에서 만연한 것으로 확인되었습니다.
우리의 방법은 이 분야에 초점을 맞춘 연구에 도움이 됩니다.
