Bugüne kadar klinik olarak doğrulanmış kimerik antijen reseptörü T-hücresi görüntüleme platformu bulunmamaktadır. Sodyum-iyodür simportörü, PET taraması ile Car T-hücrelerini görüntülemek için hassas ve klinik olarak ilgili bir muhabiri temsil eder. NIS CAR T-hücresinin TLP PET görüntülemesi, araştırmacıların infüze edilmiş hücreleri in vivo olarak invaziv olmayan bir şekilde izlemelerini sağlar ve CAR T-hücresi tedavisinin etkinliğini ve toksisitesini tahmin etme potansiyeline sahiptir.
CAR T hücrelerinin verimli görüntülenmesi, T hücresi kaçakçılığının ve genişlemesinin değerlendirilmesini sağlar ve sınırlamaların üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu protokolde açıklanan yöntem basittir ve bu çalışmada gösterilenlerin ötesinde diğer CAR yapılarına uygulanabilir. Standart yoğunluk gradyan tekniğini kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerinin veya PBMC'lerin kan örneğinden izole edilmesiyle başlayın.
Bunu yapmak için, kabarcık oluşumunu önleyen 50 mililitrelik yoğunluk gradyanı ayırma tüpüne nazikçe 15 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin. Hücre sıkışmasını önlemek için, kan örneğini bire bir hacim oranında% 2FBS içeren PBS ile seyreltin ve seyreltilmiş kanı ikisi arasındaki arayüzü kırmadan yoğunluk gradyanı ortamının üzerine yavaşça aktarın. Daha sonra ayırma tüpünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.200 kez G'de santrifüj yapın.
Süpernatantı taze bir 50 mililitrelik konik tüpe toplayın, tüpü 50 mililitreye kadar doldurarak hücreleri% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın ve tüpü oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Pelet hücrelerini% 2 FBS içeren 50 mililitre PBS'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin. % 2 FBS içeren PBS'deki peletlenmiş PBMC'leri, mililitre başına 50 kat 10 ila altıncı hücre konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın.
Yıkamayı taze 50 mililitrelik bir tüpte tekrarlayın. Hücre sayısını sayın ve ardından hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. T-hücresi izolasyonu için, izole PBMC'leri 14 mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın.
Ardından, PBMC'leri tam otomatik bir hücre ayırıcıda negatif seleksiyon antikor kokteyline yerleştirerek T hücresi izolasyonunu gerçekleştirmek için negatif seleksiyonlu manyetik boncuk kiti kullanın. T-hücresi izolasyonundan sonra, hücreleri sayın ve T hücresi genişleme ortamındaki hücreleri veya TCM'deki hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere iki kez 10 ila iki kat konsantrasyonda kültürleyin. Daha sonra, anti-CD3 / CD28 boncuklarını içeren şişeyi, gerekli boncuk hacmini döndürerek ve pipetleyerek steril bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne karıştırın.
Yıkama için, tüpü bir dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirmeden önce boncukları bir mililitre TCM'de askıya alın ve süpernatanı aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkardıktan sonra, yıkanmış boncukları bir mililitre TCM içinde tekrar edin ve yıkamayı iki kez tekrarlayın. Yıkanmış boncukları T hücreleri kültürüne aktarmak için bir mililitre TCM'de yeniden askıya alın, daha sonra T hücresi boncuk süspansiyonunu TCM ile mililitre başına altıncı hücrelere 1.0 kat 10 ila 10 konsantrasyonda seyreltin ve altı kuyucuklu bir plakaya geçirilmiş bir doku kültürüne aktarın.
Kuyu plakasını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Lentivirüslerin transdüksiyonu ile ilerlemek için, donmuş lentivirüsleri kimerik antijen reseptörlerini veya sodyum-iyodür simporterini dört santigrat derecede kaplamada çözün. 24 ila 48 saatlik T hücresi stimülasyonundan sonra, kümeleri parçalamak için T hücrelerini karıştırın ve taze çözülmüş lentivirüsü hücrelere beş enfeksiyon çokluğunda ekleyin.
Dönüştürülmüş T hücrelerini 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkanın üç, dört ve beşinci günlerinde, dönüştürülmüş T hücrelerini sayın ve taze önceden ısıtılmış TCM ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitre başına 10 kat 10 ila altıncı hücrelere ayarlayın. Püromisin direnç genini taşıyan NIS dönüştürülmüş T hücreleri için, hücrelere üç, dört ve beşinci günlerde mililitre puromisin dihidroklorür başına bir mikrogram ile muamele edin.
Altıncı günde, T hücresi kümelerini parçalayın ve plakayı bir dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirerek dönüştürülmüş T hücrelerinden anti-CD3 / CD28 boncuklarını çıkarın. Daha sonra toplanan hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere 1.0 çarpı 10 ila 10 konsantrasyonda kültüre geri yerleştirin. 50.000 hücre içeren T-hücre kültürünün bir aliquotunu akış tamponu ile yıkayın ve hücreleri 50 mikrolitre akış tamponu ile yeniden askıya alın.
CAR ekspresyonunu tespit etmek için, T hücrelerini bir mikrolitre keçi anti-fare antikoru ile boyayın. Ölü hücreleri dışlamak için, 0.3 mikrolitre LIVE / DEAD Aqua ekleyin. Lekeli hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.
15 dakika sonra, hücreleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca 650 kez G'de 150 mikrolitre akış tamponu ile yıkayın. Lekeli hücreleri sabitlemek ve geçirgenleştirmek için, hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 100 mikrolitre fiksasyon ortamı ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri, saponin ve santrifüj gibi hücre geçirgenleştirici bir ajan içeren 100 mikrolitre tamponla iki kez yıkayın.
Yıkadıktan sonra, geçirgenleştirilmiş hücreleri geçirgenleştirici bir tamponun 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Daha sonra 0.3 nanogram anti-insan ETNL NIS antikoru ekleyin ve dört santigrat derecede inkübe edin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, gösterildiği gibi 150 mikrolitre akış tamponu ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
Daha sonra hücreleri, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.5 mikrolitre anti-tavşan sekonder antikoru içeren 50 mikrolitre akış tamponu ile inkübe edin. T hücrelerini gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, akış sitometrisi yapmak için hücreleri 200 mikrolitre akış tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra hücrelerin transdüksiyon verimliliğini belirleyin.
Sekizinci günde, T hücrelerini dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 300 kez G'de sayın ve döndürün, ardından hücre peletini mililitre başına altıncı hücrelere 10 kez 10 konsantrasyonda bir dondurucu ortamla yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun bir mililitresini, eksi 80 santigrat derece dondurucuda 48 saat boyunca saklamak için etiketli her kriyo şişesine aktarın. 48 saat sonra, T hücrelerini sıvı azota aktarın.
NIS pozitif BCMA CAR T hücreleri enjekte edilen fareleri, fareleri tartarak ve metal kulak etiketlerini çıkararak PET/BT görüntüleme için hazırlayın. Daha sonra taze hazırlanmış F18 tetrafloroboratın 9.25 megabecquerel'ini kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla fareye intravenöz olarak enjekte edin. 45 dakikalık alım süresinden sonra, 15 dakika boyunca anestezi uygulanan bir farenin statik PET görüntülerini elde etmeye devam edin, ardından 360 derece dönüş ve 180 projeksiyon ile beş dakika boyunca BT görüntü alımı izleyin.
Bu temsili analizde, iki virüsün T hücrelerine birlikte transdüksiyonu, hücrelerin% 90'ından fazlasının NIS pozitif olduğu NIS pozitif BCMA CAR T hücreleri üretti. T hücresi büyüme kinetiğinin sıfırdan sekiz güne kadar analizi, BCMA CAR ve NIS'in dahil edilmesinin, dönüştürülmemiş hücrelere kıyasla T hücresi genişlemesini önemli ölçüde etkilemediğini ortaya koymuştur. OPM-2'nin akış sitometrik analizinde, lentivirüs ile transdüklenen hücreler, puromisin ile tedavi üzerine GFP ekspresyonunu temsil etti.
BCMA pozitif lusiferaz pozitif OPM-2 hücreleri alan fareler, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını doğrulamak için biyolüminesans görüntülemeye tabi tutuldu. F18 tetrafloroborat uygulanan farenin PET görüntülemesinde çeşitli organlarda ve kemik iliğinde NIS pozitif BCMA CAR T-hücre dağılımı saptandı. Ek olarak, fareden toplanan kemik iliği hücreleri, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını ve NIS pozitif BCMA CAR T hücrelerinin kemik iliğine verilmesini gösterdi.
İnfüze edilmiş CAR T hücrelerinin yüksek kaliteli görüntülenmesi için, NIS CAR T hücresi üretim protokolünün adımlarını takip etmek ve çift NIS ve CAR pozitif fraksiyonlarının varlığını doğrulamak önemlidir.
