Protokolümüz fare modeli için optimize edilmiştir ve tüm araştırmacıların kullanımına hazır materyallerkullanmaktadır. Bu teknik sağlıklı, hastalıklı veya genetik olarak değiştirilmiş fare modellerine uygulanabilir. Protokolümüz, araştırmacıların herhangi bir fare hastalığı veya genetik varyasyon modelinden kardiyak perisit biyolojisi ile ilgili soruları yanıtlamalarını sağlayacaktır.
Bu prosedür kardiyak perisit biyolojisi hakkında bilgi sağlayacak ve hem sağlık hem de hastalıkta kardiyak homeostaz ve hemodinamik katkılarının anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Anestezili fareyi supine pozisyonuna yerleştirin ve ön ayaklarını bantlayın. Göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve 25 kalibrelik kelebek iğnesi kullanarak alçalan aortu kanüle edin.
Sağ atriyumda bir çentik yap. Daha sonra, 250 birim-başına mililitre heparinize en az 20 mililitre ile kalp perfuse, kalsiyum-magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat bir değişken akış peristaltik pompa ile dakikada iki mililitre salin tamponlu. Perfüzyon temiz PBS sağ atria çıktığında tamamlanır.
Kalbi aorttan kesin ve buz gibi kalsiyum-magnezyumsuz DPBS'ye yerleştirin. Sonra kalbi 15'e 15 santimetrelik petri kabına aktar. Parçaları kapsayacak kadar enzim çözeltisi ile yay makas ve ince nokta forseps kullanarak küçük parçalar halinde kalp kesin.
Şimdi, parçaları ve çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve parafin plastik filmle kapatın. 37 derecede, yörüngesel bir çalkalayıcıyla 120 rpm'de 75 dakika kuluçkaya yat. Enzim çözeltisi ile kollajenaz sindirim sonra, yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 100 mikron hücreli süzgeç ile sıvı decant, böylece parçalar kuruması yeterli çözüm bırakarak.
İnce nokta lı forceps kullanarak, tüpten doku almak ve bir mikroskop slayt üzerine birkaç parça yerleştirin. Sonra, iki mikroskop slaytlar arasında doku kırmak için doku eziyet. Yeni bir 50 mililitrelik konik tüp içine enzimiçermeyen kültür medya ile slaytlar durulayın.
Tüm doku parçaları ayrıştırılıncaya kadar bu adımı tekrarlayın. Gergin çözeltiyi ve zeminden yukarı dokuyu tek bir tüpte birleştirin. 100 mikronluk hücreli bir süzgeçten çıkan süspansiyonu yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe zorlayın.
Numuneyi 220 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Önceki çözeltiyi aspire edin ve DPBS ve sığır serum albumini içeren soğuk FACS boyama tamponundaki hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Hücreleri sayve hücre sayacı kullanarak canlılığı kontrol edin.
DPBS ve sığır serum albumini içeren soğuk FACS boyama tamponu ile mililitre başına bir milyon hücreye hücreleri seyreltin. Hücreler artık lekelenmeye ve sıraya girmeye hazır. Tüm kontroller ve hücre örnekleri için beş mililitrelik FACS tüpleri hazırlayın ve etiketleyin.
Aliquot lekesiz bir örnek için tüp başına hücrelerin bir mililitre, floresan eksi bir kontrolleri, ve isotype eşleşen kontroller. Sıralama için kalan hücreleri kullanın. Tüm kontroller ve numuneler aynı anda hazırlanabilir ve elde edilebilir.
Ayrıca, dokuz tazminat kontrolleri, lekesiz boncuklar iki tür artı marker panelinden yedi farklı florokromlar toplam beş mililitreLIK FACS tüpleri hazırlamak ve etiket. Floresan telafi kontrollerini optimize etmek için, sıkma şişesinden her tüpe bir damla tazminat boncukekleyin. Sonra, boncuklar antikor bir mikrolitre ekleyin.
Marker panelinden her antikor için tekrarlayın. Spektral çakışma nedeniyle arka plan boyama optimize etmek için FMO kontrolleri kullanın. FMO kontrol tüpleri hücreleri için, bir-100 seyreltme marker panelinden tüm antikorlar ekleyin, ama bir antikor hariç.
Her antikor için toplam yedi kontrol için tekrarlayın. Nonspesifik boyama için isotip uyumlu kontrol antikorları kullanın. İzotip uyumlu etiketli tüplerdeki hücrelere, bir ila 100 seyreltme de isotip uyumlu kontrol antikorlarını ekleyin.
Daha sonra, sıralanacak hücreleri hazırlayın. Taze izole hücreleriçin, bir-100 seyreltme bir antikor kokteyl ekleyin. Ayrıca, bir-1, 000 seyreltme hücre canlılık boya ekleyin.
Kuvvetle darbe girdap tarafından tazminat kontrolleri karıştırın. Dört santigrat derecede 30 dakika kuluçka, ışıktan korunmuş, hücre canlılığı boncuklar hariç, hangi oda sıcaklığında bırakılabilir, ışıktan korunmaktadır. FMO kontrollerini, izotip uyumlu kontrolleri ve darbe girdaplarına göre sıralanacak hücreleri nazikçe karıştırın.
Işıktan korunan, 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Her bir telafi kontrolü, FMO kontrolü ve isotip kontrolüne üç mililitre FACS boyama tamponu ekleyin. Tüpleri 300 kez g'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.
Çözeltiyi aspire edin ve her peleti 400 mikrolitre FACS boyama tamponunda yeniden askıya alın. Telafi kontrolleri, FMO denetimleri ve isotip denetimleri artık kullanıma hazır. Boyama sonrasında hücreleri, 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g santrifüj ile FACS boyama tamponu ile yıkayın.
Çözeltiyi aspire edin ve FACS boyama tamponundaki hücre peletini mililitre başına 0,5 milyon hücreye yeniden askıya alın. 35 mikron filtre üstleri olan yeni FACS tüpleri kullanarak, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için kapaklar ve yerçekimi filtrasyon üzerine lekeli hücre örnekleri pipet. Buzda kal.
Hücreleri arındırmak için bir hücre ayırıcıkullanın. Voltajları ayarlamak ve arka plan sinyalini düzeltmek için hücre ayırıcısındaki lekesiz hücreleri çalıştırın. Her kanal için voltajları ayarlamak ve pozitif sinyal için kapıları ayarlamak için her tek renkli kompanzasyon boncuk örneğini teker teker çalıştırın.
Verileri toplayın. Kompanse matrisini hesaplayarak spektral çakışmayı hesaplamak için yazılımı kullanın. Tüm voltajlar hazır ve ayarlanmış.
Her isotype denetimini teker teker çalıştırın. Bu veriler, varsa belirli olmayan bağlama için kapıları ayarlamak için kullanılabilir. Her FMO örneğini aynı anda çalıştırın.
Çok renkli bir panel sayesinde spektral kanamayı düzeltmek için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Lekeli hücre örneklerini hücre ayırıcısında çalıştırın. 15 mililitrelik konik toplama tüpünde 10 mililitrelik enzimsiz kültür medyasında hücreleri toplayın.
Aşağıdaki gating stratejisini kullanın. İlk olarak, tek hücre kapısı. Sonra, canlı hücreler için kapı.
Sonra, CD45-negatif hücreler için kapı. CD34 ve CD31-negatif hücreler için kapı. Sonra, NG2-pozitif hücreler için kapı.
Ve son olarak, CD146 ve CD140b-pozitif hücreler için kapı. Kültür perisitleri için, 24 kuyulu bir tabakta enzimsiz kültür medyasında taze elde edilen hücreleri tohumlayın. Kültür bir hücre kuluçka hücreleri 37 santigrat derece, 5% karbondioksit ve% 95 oksijen olarak ayarlayın.
Enzimatik sindirim ve tüm kalbin dissociation sonra ve hücrelerin FACS arıtma önce, hücreler kalpten birçok farklı hücre türleri içeren kaba bir karışımdır. FACS arınma ve kültürlenme den sonra hücreler homojendir. Onlar tek çekirdekli, oldukça düz, ve tipik perisit rhomboid morfolojisi var.
FACS kullanılarak hücreler homojenolarak saflaştırılır. İlk olarak, enkaz ve doublets ileri ve yan dağılım dağılımları dayalı dışarı kapılı edildi. Daha sonra, ölü hücreler boya ile amin reaksiyonu nedeniyle dışarı kapılı edildi, hangi canlı hücrelerden daha büyük ve daha yoğun bir sinyal üretir.
Canlı hücrelerden hematopoetik hücreler CD45-pozitif olarak çıkarıldı. Hematopoetik ve endotel hücrelerini daha da uzaklaştırmak için CD34-pozitif ve CD31-pozitif hücreler çıkarıldı. Son olarak, tipik perisit belirteçleri ekspresyonu ile perivasküler hücreler olduğu için NG2-pozitif ve CD140b/CD146-pozitif hücreler seçildi.
İnsan beyin perisitleri ile karşılaştırıldığında, hücreler benzer bir morfolojiye sahipti. Fare ve insan düz kas hücreleri ile karşılaştırıldığında, hücreler perisit belirteçleri için immünositokimya ile yedinci geçitte hücrelerin farklı morfoloji Sinotik karakterizasyonu vardı morfoloji veya marker ekspresyonu gözlenen bir değişiklik gösterdi. Benzer şekilde, yedinci geçitteki perisitlerin akış sitometrisi ile yapılan analizler popülasyonun homojen kaldığını doğrulamıştır.
Hücre canlılığı iyi bir verim elde etmek için önemlidir. Satın alma sırasında doku soğuk tutun ve hücre boyama sırasında hücreleri soğuk tutun. Ayrıca, enzimatik çözeltinin her seferinde taze olarak hazırlandıklısun.
Doku sonrası doğru hücrelerin izolasyonu sağlamak için, akış sitometrisi ve immünofloresan boyama ile karakterize edin. Bu hücreler fonksiyonel bariyer çalışmaları için endotel hücreleri ile coculture deneylerde kullanılabilir, hem de biyolojik ve fizyolojik fonksiyon ve özelliklerini incelemek için tahliller. Kardiyak perisitler vasküler bütünlük ve stabilitede temel bir rol oynarlar ve disfonksiyonları küresel kardiyak fonksiyona bağlıdır.
Bizim tekniği ile, araştırmacılar kardiyak perisitlerin terapötik potansiyelini keşfedebilirsiniz.
