EV'lerin karmaşık doğası, ilgilenilen alt popülasyonu tanımayı zorlaştırır ve bu protokol onları fenotipleri, boyut profilleri ve nanomekanik özellikleri ile tespit edebilir. Bu teknik kombinasyonu, EV'leri durum ortamından ve kan plazmasından gerçek zamanlı olarak tespit etmemizi sağlayan etiketsiz bir yöntemdir. Bu teknik, patolojinin biyogöstergeleri olarak kullanılmak üzere veya ayrıca ilaç dağıtımı için nanopartikül olarak kullanılmak üzere ilgilenilen nanopartiküllerin derin alt kümesini karakterize etmeyi sağlar.
Çok hassas bir yöntem olduğundan, ilgilendiğiniz numuneyi enjekte etmeden önce biyoçip preparatına dikkat etmeniz zorunludur. Talaşları kapladıktan ve işlevselleştirdikten sonra, biyoçipi oda sıcaklığında karanlıkta en az 30 dakika boyunca 200 milimolar etil dimetilaminopropil karbodiimid / N-hidroksissüksinamid ve litre başına 50 milimolar N-hidroksisüksinamid karışımında inkübe edin. Gözcüyü kullanarak, 300 nanolitre ligand çözeltisi ekleyin ve biyoçipi 30 dakika boyunca sonik bir banyo altında inkübe edin.
Biyoçipi üstten ultra saf suyla yıkayın. Biyoçip ve prizma arasında düzgün bir ince tabaka oluşturmak için prizma ile aynı kırılma indisine sahip bir damla yağ damlacığı ekleyin ve biyoçip ile aynı kırılma indisine sahip bir prizmaya yavaşça yerleştirin. Yüzey plazmon rezonans görüntülemesi için, biyoçipi SPRi sistemine monte edin.
Yazılımın sol tarafındaki açılır menüye gidin ve Çalışma dizinine tıklayın. Farklı noktaların görünür olduğu görüntüyü bulun ve bu görüntüyü seçmek için tıklatın. Ardından ligand ailelerinin adını yazın ve Finish türü tanımına tıklayın.
Siyah çizgiyi imleçle optimum çalışma açısına sürükleyin. Aynayı çalışma açısına taşı'ya tıklayın ve bir çalışma açısı seçin. Şimdi Kinetics'e tıklayın.
Yazılım kullanıcıdan negatif kontrolü tanımlamasını istediğinden, bu noktada Negatif kontrol yok'u seçin. Sıçan serum albüminini dört dakika boyunca dakikada 50 mikrolitrede enjekte edin. Yüzeyde hala mevcut ve reaktif olan karboksilik grupları devre dışı bırakmak için 10 dakika boyunca dakikada 20 mikrolitrede etanolamin enjekte edin.
Daha sonra, biyoçipi dört dakika boyunca dakikada 50 mikrolitrede 40 milimolar OG enjekte ederek yıkayın. Hücre dışı vezikülleri, biyofonksiyonel çip üzerinde belirli bir konsantrasyonda enjekte ederken, aynı anda farklı noktalardaki veziküllerin etkileşiminin kinetiği takip edin. Ayrıca yansıtıcılığın değerini ve etkileşim seviyesini de belirleyin.
Stabilize edildikten sonra, AFM görüntülemeyi yapmadan önce hücre dışı vezikülleri bulundukları yere sabitlemek için çip üzerine glutaraldehit enjekte edin. Cam slayttaki maskenin üstündeki biyoçipi hizalayın. Konsolları taranması gereken doğru noktaya yerleştirmek için AFM'nin üstündeki CCD kamerayı kullanın.
AFM alımını temas modunda üç ila beş büyük alandan küçük alanlara doğru başlatın. Ardından, önce yükseklik kanalını seçerek AFM görüntülerini JPK veri işleme yazılımıyla işleyin. Düzleştirilmiş tarama çizgileri elde etmek için her çizgiden çıkarılacak bir polinom uyumu seçin.
Yüzeydeki pürüzlülüğü ortadan kaldırmak için altın taneleri üzerindeki yükseklik eşiğini seçin. Tahıl ekstraksiyon modülü, 8.5 nanometrelik bir yükseklik eşiği kullanarak taneleri işaretler. Albümin pasivasyonundan sonra çoklanmış biyoçipler analiz edildi.
Varsayılan değeri olmayan çip. Lekelerin füzyonu, zayıf aşılama veya kabarcıklar veya kirleticiler nedeniyle bazı kusurları olan çip. Ve hücre dışı veziküllerin altın üzerindeki adsorpsiyonunu incelemek için mikrodizileri olmayan çıplak bir altın çip gösterilmiştir.
Çok katlı bir biyoçip üzerindeki yakalama deneyi, farklı ligandlar için iyi yansıtıcılık sinyalleri ve farklı ligandlar için iyi bir sinyal-gürültü oranı gösterdi, çünkü negatif kontrolün tepkisi ihmal edilebilirdi. Hücre dışı vezikül örneğinin enjeksiyonundan sonra hücre dışı vezikül adsorpsiyonu, yüksek yansıtıcılık sinyali gösterdi, bu da bu veziküllerin altın çip üzerinde adsorbe edebileceğini ve sabit kalabildiğini düşündürdü. Hücre dışı vezikül yüklemesinden sonra, biyoçipler üzerindeki hücre dışı veziküllerin büyük ölçekli ve küçük ölçekli AFM görüntüleri üretildi.
Yüksek çözünürlüklü daha yakından görünüm, hücre dışı veziküllerin metrolojisini mümkün kılar. Bir biyoçip üzerindeki hücre dışı veziküllerin etkili çapı 30 ila 300 nanometre arasında değişmekte olup, büyük çoğunluğu 60 nanometre civarındadır. Havada ve sıvıda elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilirdi.
Çıplak bir çip üzerinde adsorbe edilen hücre dışı veziküllerin Raman spektrumu, esas olarak hücre dışı vezikül zarlarının lipitleriyle ilişkili metilen titreşimlerine karşılık gelen zirvelerle net bir spektrum ortaya çıkardı. EV'lerinizi doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde tespit edebilmek için biyoçipinizi titizlikle hazırlamanız önemlidir. Batı lekelenmesi ve nanopartikül izleme analizi gibi geleneksel yöntemler, fenotipleri ve boyut modellerini ilişkilendirmek ve doğrulamak için kullanılabilir.
Dahası, multi-omik analizlerin EV moleküler karakterizasyonuna ve potansiyel alt küme ayrımcılığına daha da derine inmesi öngörülmektedir.
