생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

이 프로토콜은 동일한 마우스에서 광시야 및 단일 세포 예약 활동을 측정하기 위해 큰 두개골 창을 만드는 것을 보여줍니다. 우리의 방법을 사용하면 저렴한 비용으로 식품 랩으로 크고 안정적인 두개골 창을 만들 수 있습니다. 이 방법은 거시적 및 미시적 수준에서 행동 중 신경 및 신경교 활동을 연구하는 데 효과적입니다.

작은 두개골 창으로 시작하는 것이 좋습니다. 그런 다음 성공하면 창 크기를 늘립니다. 치과 드릴로 두개골 위의 여분의 시멘트를 제거하는 것으로 시작하십시오.

절단 할 영역을 펜으로 표시하십시오. 끝이 두개골을 관통하지 않도록 끝이 뭉툭한 메스를 사용하여 뼈를 자릅니다. 메스로 뼈를 반복적으로 긁어 가볍게 만졌을 때 다듬을 부위의 뼈가 움직일 때까지 홈을 깊게합니다.

미세한 핀셋으로 절개 된 뼈를 제거하십시오. 뇌를 손상시킬 수 있는 뼈 플랩을 뇌에 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 경막을 제거하려면 약 10 마이크로 미터의 테이퍼 팁이있는 당겨진 유리 피펫을 사용하여 경막을 자릅니다.

U 자형 바늘을 사용하여이 컷을 전체 창에 걸쳐 확장하십시오. 60-100x 줌으로 설정된 실체 현미경에서 초미세 핀셋으로 절단된 경막을 제거합니다. 출혈의 경우, aCSF로 헹구거나 젤라틴 스폰지를 사용하여 출혈을 멈추십시오.

그런 다음 PVDC 랩의 큰 조각을 오토클레이빙과 70% 에탄올로 멸균합니다. 실체 현미경으로 핀셋과 메스를 사용하여 필요한 크기의 랩을 잘라냅니다. 표면에 aCSF를 남겨두고 뇌 표면에 랩을 놓습니다.

랩 가장자리에서 aCSF를 빨아 들여 랩이 뇌 표면에 단단히 달라 붙도록합니다. 두개골 창의 가장자리와 랩 사이에 약 1mm의 여백이 있도록 메스와 핀셋으로 랩을 자릅니다. 랩이 제자리에 있으면 랩의 가장자리를 생물학적 접착제로 두개골에 붙입니다.

접착제를 약 30분 동안 건조시키십시오. 혼합 팁이 있는 디스펜서를 사용하여 랩 위에 투명한 실리콘 엘라스토머를 바릅니다. 두께 0.12-0.17 밀리미터의 커버 유리를 위에 놓습니다.

커버 유리의 둘레를 방수 필름, 슈퍼 접착제 또는 치과 용 시멘트로 밀봉하십시오. 먼저 피브로인과 AAV 용액을 작은 샘플 튜브에 1 대 4 비율로 혼합합니다. 용액의 분취량을 두개골 창의 플라스틱 랩에 떨어 뜨리고 적어도 3 시간 동안 건조시킵니다.

그런 다음 이전 섹션에 표시된 대로 랩을 뇌 표면에 부착합니다. 생쥐와 창문의 상태를 2-4 주 동안 정기적으로 확인하십시오. 이때까지 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표는 AAV 처리 창을 만든 후 충분히 발현됩니다.

이 프로토콜을 사용하면 최대 10 주 동안 10 마리의 마우스 중 8 마리에서 두개골 창을 유지할 수 있습니다. 성상 세포에서 막에 고정 된 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표를 발현하는 형질 전환 마우스에서 플라스틱 랩, 투명한 실리콘 및 커버 유리로 넓은 창이 만들어집니다. 이 창을 통해 광시야 칼슘 이미징을 수행했으며 공기 퍼프 자극을 반대쪽 수염에 적용했을 때 형광 변화가 관찰되었습니다.

체성 감각 피질의 형광 변화의 시간 경과는 피질 활동을 보였다. 이광자 이미징을 통해 신경교 세포에 특이적인 단일 세포 형광 이미지를 관찰할 수 있었습니다. 감각 자극에 의해 유도 된 형광 변화는 상이한 피질 영역의 개별 세포에서 관찰되었다.

랩은 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지시약을 발현하는 AAV로 코딩되었으며, 피브로인은 두개골 창을 만드는 데 사용되었습니다. 광시야 칼슘 영상은 수술 후 2-4 주 후에 감각 자극에 의해 유도 된 피질을 가로 질러 전파되는 피질 활동을 보여주었습니다. 창이 크기 때문에 동일한 마우스의 다른 피질 영역을 이미지화하고 감각 자극에 의해 유도 된 형광 변화를 개별 세포에서 볼 수있었습니다.

두개골 창을 만들 때 뇌 손상을 피하는 것이 중요합니다. 큰 두개골 창이있는 마우스에서 행동 작업을 수행 할 수 있습니다. 이를 통해 신경 활동과 마우스 행동 사이의 관계를 조사 할 수 있습니다.

이 방법은 다양한 신경 과학 연구에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 의사 결정 작업, 모터 달리기 및 뇌 손상 및 질병의 대량 모델에서 피질 활동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.