Bu protokol, bağışıklık hücresi kimliğini ve saflığını belirlemek için standart laştırılmış bir yöntem sunar ve büyük numune gereksinimi, kullanıcı değişkenliği yüksek kullanıcı ve öznel veri analizi gibi akış sitometrisinin sınırlandırılmasını gidermektedir. Bu tahlil, kullanıcıların bağışıklık hücresi kimliğini ve saflığını objektif olarak değerlendirmelerine olanak tanıyan otomatik bir veri analizi şablonu içerir. Bu, birden fazla test kontrolleri ile birlikte bağışıklık hücresi kimliği ve saflığı değerlendirmek için anahtar teslimi, kolayca standart bir yöntem sunuyor.
Bu tekniği gösteren Jerry Guzman, bizim laboratuvarda bir bilim adamı olacaktır. Hematopoetik hücre örneğinden genomik DNA izolasyonundan sonra, 260, 280 ve 230 nanometrede optik yoğunluk elde ederek numunenin spektrofotometredeki saflığını ölçmek için genomik DNA'nın bir mikrolitresini kullanın. Sonraki seyreltmek 400-1200 genomik DNA örneği nanogram bir genomik DNA izolasyon kiti elüsyon tampon ile 142 mikrolitre son hacmi.
67 mikrolitre elüsyon tamponuna 75 mikrolitre kalibratör ekleyin. Ve referans genomik DNA'nın 1200 nanogramını toplam 142 mikrolitre lik elüsyon tamponu ile seyreltin. Daha sonra tüpleri 56 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın ve termal mikserde dakikada 900 devir.
Bisülfit dönüşümü için tüm tüplere 270 mikrolitre amonyum bisülfit ve 90 mikrolitre THFA ekleyin. Ve tam bir karıştırma sağlamak için tüpler girdap. Sıvıyı toplamak için numuneleri kısaca aşağı doğru döndürün ve tüpleri 80 santigrat derecede 45 dakika termal miksere yerleştirin ve dakikada 900 devir.
Daha sonra örnekleri kısa bir süre tekrar aşağı çevirin ve 3-5 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bisülfit dönüşümden sonra DNA arınması için, 30 saniye boyunca DNA izolasyonu paramanyetik boncuklar girdap. Şişelerde listelenen hacimlere göre yıkama tamponlarına etanol ve isopropanol ekleyin.
Girdap tekrar boncuklar tamamen resuspended ve lizis bağlayıcı tampon 870 mikrolitre ve DNA bağlayıcı paramanyetik boncuklar her tüp için 105 mikrolitre de. Kısa bir süre örnekleri aşağı dönmeden önce karıştırmak için tüpler girdap. Her tüp e 570 mikrolitre 2-propanol ekleyin ve girdap ile karıştırın.
Tüpleri oda sıcaklığında yedi dakika ve dakikada 50 RPM'de kuluçkaya yatırın ve tüpleri tekrar aşağı doğru döndürün ve beş dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Kuluçka sonunda boncuk rahatsız etmeden supernate kaldırın. Arabellek 1 ile numuneyi yıkayın ve tüpleri girdap.
Kısa bir santrifüjden sonra tüpleri üç dakika rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden süpernate'i çıkarın. Numuneyi yıkama tamponu 2 ile iki kez yıkayın ve tüpleri 65 derecede 15 dakika kurulayın. Sonra, her tüp için 60 mikrolitre evrim tampon ekleyin.
Oda sıcaklığında yedi dakikalık bir kuluçka ve dakikada 1400 dönüşten sonra, tüpleri kısa bir süre aşağı döndürün ve tüpleri iki dakika lığına mıknatısa geri verin. Kuluçka sonunda 55 mikrolitre bisülfit dna içeren dna boncukları rahatsız etmeden yeni bir tüpe dönüştürür. Örneklerüzerinde nicel PCR çalıştırmak için, nicel PCR yazılımında her standart Görev Standardı atayın ve tabloya göre son kopya numaralarını belirtin.
Standart DNA'nın seri seyreltmelerini hazırlayın ve hedef hücre tipi için bir nicel PCR ana karışım kokteyli hazırlayın. Ve GAPDH için bir nicel PCR ana mix kokteyl, tabloya göre. Şablon DNA'sının üç mikrolitresini 96 iyi yuvarlanmış alt plakanın uygun kuyularına yükleyin ve ardından yedi mikrolitre ana karışım verin.
Tüm kuyular yüklendiğinde plakayı nicel PCR filmle kapatın ve plakayı kantitatif PCR aletine yüklemeden önce kısa bir süre döndürün. Daha sonra tabloda belirtildiği gibi reaksiyon çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, nicel PCR verilerini txt veya xlsx dosyası olarak dışa aktarın.
Bisülfit insaflı DNA'yı paramanyetik atımlarla arındırdıktan sonra, DNA'nın 25 mikrolitresini eute. Bisülfit dönüştürülmüş DNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve numunenin iki mikrolitresini tek tek PCR şerit tüplerine ekleyin. Hiçbir şablon kontrol tüpüne iki mikrolitre su ekleyin ve tabloya göre tüm numuneler için preamplifikasyon ana karışımını hazırlayın.
Her tüp ve kapak, girdap ana karışımı 23 mikrolitre ekleyin ve kısaca tüpler aşağı spin. Daha sonra ısıtılmış bir kapak kullanarak bir termo cycler üzerinde preamplifikasyon protokolü çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra, kısaca tüpler aşağı spin ve yeni tüpler için güçlendirilmiş DNA mikrolitre aktarın.
Daha sonra numuneleri 78 mikro litre su ile 1 ila 40 konsantrasyona seyreltin ve gösterildiği gibi örneklerin nicel PCR'sini çalıştırın. Burada hem periferik kan, hem mononükleer hücreler hem de üç farklı donörden elde edilen CD8+T hücre tahlillerinden elde edilen temsili veriler hem akış sitometrisi hem de metilasyon tahlilleri ile gösterilmiştir. Her iki hücre tipinde tüm donörler arasında iki yöntem arasındaki eğilimler benzerdi.
Treg tahlilinden elde edilen bu temsili veriler de yöntemler arasında benzer sonuçlar göstermektedir. Ancak, her durumda, bu metilasyon test hem uyarılmış ve uyarılmamış koşullar altında daha yüksek değerler verdi. Her bir tözün duyarlılığı ve özgüllüğü Boşluk Sınırı, Algılama Sınırı ve Nicelik değerleri sınırı ile gösterilmiştir.
Bu tahlil otomatik bir veri çözümleme şablonu sunduğundan, nesnel çözümlemeyi geliştirir ve standartlaştırma yeteneklerini artırır. Bu standart yöntemler tutarlı bir hücre terapisi ürün oluşturmak için çok önemli olduğu hücre tedavisi üretimi için idealdir.
