Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde amino asit tükenmesi yoluyla otofajinin nasıl indükleneceğini ve mutant klonlar arasındaki otofajideki farklılıkların nasıl analiz edileceğini açıklar. Otofaji, kültür koşullarında beslenme mevcudiyetine karşı oldukça hassas olduğundan, aynı dokudaki vahşi tip hücrelere karşı mutant hücreleri analiz eden bir yöntem olan klonal analiz, otofaji defektlerinin diseksiyonunda bir avantaja sahiptir. Üç erkek ve 15 dişi yetişkin sineği, çiftleşme için 25 santigrat derecede standart mısır unu veya pekmez veya agar Drosophila media içeren bir kültür şişesine sokarak başlayın.
İndüksiyondan 48 saat sonra, sinekler sersemleyene kadar çiftleşme şişesine dokunun ve şişenin tabanındaki ortamın üzerine bırakın. Çiftleşme şişesinin fişini çekin ve ağzını taze medya ile fişi çekilmiş ters çevrilmiş bir kültür şişesi ile kapatın. Ardından, sinekleri taze kültür şişesine aktarmak için şişeleri çevirin ve dokunun.
Taze kültür şişesini takın ve eski şişeyi atın. Taze kültür şişesini, taze ortama yumurtlamak için 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Altı saatlik yumurtlamadan sonra sinekleri çıkarın ve% 75 etanol içeren bir şişeye atarak sinekleri atın.
Flippase ekspresyonunu indüklemek için şişeyi embriyolarla 37 santigrat derecelik bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, onları 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve embriyoların gelişmeye devam etmesine izin verin. Bir laboratuvar spatulası kullanarak, gelişmekte olan larvaları içeren ortamı, yumurtlamadan 75 saat sonra bir Petri kabına alın.
Yemeğe 1X PBS ekleyin ve uzun forseps kullanarak kültür ortamını ve larvaları yavaşça ayırın. Sonra 10 ila 15 erken üçüncü instar larvasını seçin. Dokuz kuyucuklu bir cam çöküntü spot plakasının kuyularını 1X PBS ile doldurun ve ayrılmış üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak kuyucuklara yerleştirin.
Tüm ortam kalıntılarını gidermek için larvaları iyice yıkayın. Boş bir şişeye beş mililitre% 20 sakkaroz çözeltisi alın ve temiz üçüncü instar larvalarını uzun forseps kullanarak bu çözeltiye yerleştirin. Bu şişeyi, diseksiyon için hasat etmeden önce altı saat boyunca 25 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin.
Dokuz kuyucuklu cam çöküntü spot plakasının her bir kuyucuğuna 1X PBS ekleyin ve larvaları uzun forsepslerle kuyucuklara aktarın. Bir larvayı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bir kuyuya yerleştirin. Larva gövdesinin ortasındaki iki 5 forseps ile larvaların kütikülünü tutun ve tırnak etlerini yavaşça yırtın.
Maruz kalan yağ gövdeleri, diğer larva iç dokuları ile birlikte, larvaların karkasına hala bağlanacaktır. İç organları mümkün olduğunca açığa çıkaracak kadar çekin. Tüm larvalar için bu adımı tekrarlayın.
Larva karkası, 500 mikrolitre% 4 PFA içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri sallamadan 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra PFA çözeltisini pipetleyin. Tüpe 500 mikrolitre 1X PBS ekleyin.
Tüpü düz bir rotatör üzerinde 10 dakika boyunca yavaşça çalkalayın ve ardından 1X PBS çözeltisini atın. Bunu üç kez tekrarlayın. Uzun forsepsler kullanarak, sabit ve yıkanmış larva karkasını, 1X PBS ile doldurulmuş dokuz çöküntü nokta plakasındaki bir kuyuya aktarın.
Yağsız tüm vücut dokularını 5 forseps ile çıkarın. Son olarak, yağ gövdesinin parçalarını, montaj ortamı olarak% 80 gliserol kullanarak bir mikroskop slaydına monte edin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Mutant bir ve mutant iki, X kromozomu üzerinde iki bağımsız ölümcül mutanttır ve izojenize sarı beyaz FRT 19A sinekleri burada bir kontrol görevi görür.
GFP-Atg8a paternleri kontrol, mutant bir veya mutant iki mozaik larva yağ gövdesinde analiz edildi ve mutant klonlar veya kontrol klonları RFP ile negatif olarak işaretlendi. Kontrol klonlarında, GFP-Atg8a Puncta'nın kalıpları, çevredeki RFP pozitif hücrelerdekilere benzerdi. Mutant bir mutant klonda, GFP-Atg8a Puncta büyük ölçüde azaldı.
Ve mutant iki mutant klonda, GFP-Atg8a Puncta'nın sayısı ve büyüklüğü arttı. Larva gelişim aşaması burada kritiktir. Gelişim süresi ve açlık süresi, her laboratuvarın kültür ortamı tariflerine göre değiştirilmelidir.
Bu prosedür seçici otofajiyi araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, mitopaji, bir mitokondriyal hedefleme dizisine bir floresan proteini ekleyerek sinek yağ gövdelerinde izlenebilir.
