Bu protokol, klinik veya çevresel örneklerin bulaşıcılığını bildirebilecek algılama molekülü elde etmek için bulaşıcı virüsleri bulaşıcı olmayan virüslere karşı ayırt edebilen DNA aptamerlerinin nasıl seçileceğini açıklar. Bu teknik, ortaya çıkan virüsler de dahil olmak üzere diğer birçok virüs için seçici aptamerler elde etmek için uygulanabilir, çünkü virüsün yapıları veya dizileri hakkında önceden bilgi gerektirmez. Bu teknik, birinin bulaşıcı olup olmadığını veya çevresel bir dezenfeksiyon yönteminin amaçlandığı gibi çalışıp çalışmadığını tespit etmek için bulaşıcı virüslerin klinik teşhisi ve çevresel izlenmesi için aptamer sensörlerinin geliştirilmesine izin verir.
Seçim, özellikle yeni olanlar için zor bir süreç olabilir. PCR koşullarını optimize etmek ve qPCR ile seçimin ilerlemesini izlemek önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Marcos Gramajo olacak.
Başlamak için, ilk tek sarmallı veya SS-DNA kütüphanesini ve primerlerini tasarlayın. DNA oligolarını standart tuzdan arındırma saflaştırma ile ticari kaynaklardan elde edin. SS-DNA kütüphanesini ve primerleri% 10 denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezi ve ardından etanol çökeltmesi ile saflaştırın.
Daha sonra, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüslerin stok çözeltisini elde edin veya bunları metin makalesinde açıklandığı gibi hazırlayın. SS-DNA kütüphanesinin denatürasyonu için, 10 mikrolitre 100 mikromolar SS-DNA kütüphanesini 240 mikrolitre SELEX tamponu ile karıştırın. Karışımı kuru bir banyoda 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın, ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Pozitif seleksiyon için 250 mikrolitre SS-DNA kütüphanesini SELEX tamponunda 50 mikrolitre bulaşıcı virüs ile karıştırın. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, spesifik olmayan bölgeleri engellemek için 0,5 mililitrelik bir filtreye bir milimolar T20 dizisinin 400 mikrolitresini ekleyin.
Filtreleri 30 dakika boyunca inkübe edin. T20 çözeltisini çıkarmak için filtreyi 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, fazla T20 dizilerini gidermek için filtreyi SELEX tamponu ile üç kez yıkayın.
Ardından, SS-DNA kütüphanesi enfeksiyöz virüs karışımını bloke edilmiş 100 kilodalton filtreye ve bağlanmamış dizileri yıkamak için santrifüje ekleyin. 400 mikrolitre SELEX tamponu ve santrifüjleme ekleyerek filtreyi üç kez yıkayın. Kesiri filtrede tutun ve akışı atın.
Bağlı dizileri elde etmek için, santrifüj filtresinin toplama tüpünü değiştirin ve filtreye sekiz molar üre içeren 300 mikrolitre SELEX tamponu ekleyin. Filtreyi 15 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın, ardından salınan dizileri içeren akışı toplamak için santrifüj yapın. İşiniz bittiğinde, malzemeleri% 10 ağartıcı ile yıkayın.
Daha sonra, önceki adımda toplanan SS-DNA bulaşıcı virüs çözeltisini bloke edilmiş 10 kilodalton filtreye ekleyin, 15 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüj yapın ve akışı atın. Üreyi santrifüjleme ile çıkarmak ve akışı atmak için filtreyi 300 mikrolitre SELEX tamponu ile üç kez yıkayın. Filtredeki çözeltiyi temiz bir toplama tüpünde baş aşağı çevirerek ve beş dakika boyunca santrifüj yaparak geri kazanın.
Bir pipet kullanarak geri kazanılan çözeltinin son hacmini ölçün ve Round 1A numune olarak etiketleyin. İlk turda Round 1A örneğinin %90'ını şablon olarak alın ve optimize edilmiş koşulları kullanarak PCR'yi çalıştırın. Streptavidin modifiye manyetik boncuklar veya MB kullanarak SS-DNA'yı kurtarmak için, ürünü 50 mikrolitre alikotlara bölün ve bunları 50 mikrolitre MB içeren mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında hafif ajitasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin.
Ardından, MB'yi izole etmek ve süpernatantı pipetleme ile çıkarmak için tüpü manyetik rafa yerleştirin. Tüpe 200 mikrolitre bağlama ve yıkama tamponu ekleyerek MB'yi iki kez yıkayın. Ardından tüpü manyetik raftan çıkarın ve MB'yi pipetleme yoluyla homojen bir çözeltiye yeniden askıya almadan önce tüpe dokunun.
Tüpü tekrar manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. İkinci yıkamadan sonra, MB'yi 100 mikrolitre SELEX tamponunda tekrar askıya alın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Tüpü hemen manyetik rafa yerleştirin ve SS-DNA havuzunu içeren süpernatantı toplayın.
50 mikrolitre SELEX tamponu ekleyerek bu kurtarma adımını tekrarlayın. Geri kazanılan fraksiyonun son hacmini ölçün ve Yuvarlak 1X olarak etiketleyin. SS-DNA havuzunun denatürasyonu için, Round 1X numunesinin% 60'ını alın ve 50 mikrolitre SELEX tamponu ile karıştırın.
Numuneyi kuru bir banyoda ısıtın, ardından tüpü 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, denatüre SS-DNA havuzunu SELEX tamponunda karşı seçim adımı olarak her virüsün 50 mikrolitresi ile karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Santrifüj filtrelerinde spesifik olmayan bölgeleri bloke ettikten sonra, bir virüs çözeltisi ile inkübe edilmiş karışım denatüre SS-DNA havuzunu bloke edilmiş 100 kilodalton filtreye ekleyin.
Filtreyi 14.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve akışı toplayın. 300 mikrolitre fraksiyon alın ve mililitre başına 100 milyon kopya içeren 50 mikrolitre bulaşıcı virüs ile karıştırın. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.
Standart bir qPCR ana karışımı ve metinde açıklandığı gibi saflaştırılmış SS-DNA kütüphanesinin seyreltmelerini hazırlayın. Eşik döngüsünü belirlemek için qPCR'yi çalıştırın. Koşudan sonra, Round 1A ve Round 1X'teki SS-DNA miktarını ölçmek için standart bir eğri kullanın.
Daha sonra elüsyon verimini, bağlı DNA miktarının ilk DNA miktarına bölünmesiyle hesaplayın ve elüsyon verimini yuvarlak sayıya karşı çizin. Son olarak, farklı turlar için erime eğrilerini çizin. Yüksek verimli sıralama için, piyasada bulunan uygun bir kit seçin.
Yüksek, orta ve düşük zenginleştirmeyi temsil eden birden fazla seçim turu havuzunun yanı sıra her havuz için bağdaştırıcılarda farklı bir dizin çifti kullanarak son havuzu hazırlayın. Daha sonra hazırlanan son kütüphaneyi sıralama tesisine gönderin. Sıralama analizi için, diziler sıralama tesisi tarafından çoğuldan arındırılmıştır.
Cutadapt komut satırı programını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını ve seçim astarlarını çıkarın. Ardından, düşük kaliteli dizileri kaldırmak için FASTX-Toolkit programını kullanın. Ardından, ters yön dosyalarındaki FASTX-Araç Seti FASTX_reverse_ tamamlama işlevini kullanarak sıra dosyalarını ters yöndekilerle birleştirin.
Ardından, dosyaları tek bir dosyada birleştirmek için yerleşik CAT programını kullanın. Farklı seçim havuzlarındaki dizilerin zenginleştirilmesini analiz etmek için FASTAptamer analiz araç setini kullanın. İlk olarak, benzer dizileri kümeler halinde gruplandırmak için FASTAptamer sayısı ve FASTAptamer küme işlevlerini kullanmak.
Ardından, dizilerin ve kümelerin zenginleştirilmesi hakkında bilgi almak için FASTAptamer zenginleştirme işlevini kullanın. Dizi analizi yoluyla elde edilen zenginleştirme bilgilerinden aday aptamer dizilerini tanımlayın. Birkaç aptamer dizisi seçin ve bir bağlama testi kullanarak ilk taramayı gerçekleştirin.
Bu analizde, enfeksiyöz SARS-CoV-2 spesifik aptamerlerinin SELEX'inin ilerlemesini izlemek için qPCR kullanılmıştır. Elüsyon verimi başlangıçta her SELEX turunda arttı ve sekizinci ve dokuzuncu turlarda seviyelendirildi. Erime eğrilerini karşılaştırarak, 77 ila 79 santigrat derece arasında yüksek bir erime sıcaklığında zirveden bir kayma gözlendi.
Dahası, son iki turda, düşük erime sıcaklığında bir tepe gözlendi. Ardışık seçim turlarında elde edilen sıralı SARS2 AR10 için milyonda okumalardaki göreceli bolluk gösterilmiştir. SARS2 AR10'un öngörülen yapısı, virüsün tanınmasında rol oynayabilecek bir kök döngü bölgesi içeren yapılandırılmış bir ikincil yapı gösterdi.
Aptamerler elde edildikten sonra, virüs bulaşıcılığını bildirebilecek portal ve hızlı virüs tespit testi geliştirmek için başka bir sensör türü olan elektriksel optiklere dahil edilebilirler. Farklı varyantlara veya virüs klişelerine özgü aptamerlerin elde edilebileceğini ve toplum için en büyük tehdit olan varyantların hızlı bir şekilde izlenmesini mümkün kılacağını öngörüyoruz.
