Bu protokol, ilaç keşfi ve gelişimi alanında, özellikle de en az yan etkiye sahip yeni, birinci sınıf ilaçların geliştirilmesinde yüksek bir etkiye sahiptir. Bu tekniğin en büyük avantajı herhangi bir GPCR sistemine uygulanabilir ve gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde reseptör farmakolojisi hakkında doğru bilgi elde etmek için kullanılır. Bu tekniğin sonuçları, özellikle beta-arrestinlerin ilgili olduğu yeni tedaviler ile yakından ilişkilidir.
Bunlar arasında şizofrenide ağrı ve dopamin reseptörlerinde opiod reseptörleri sayılabilir. Bu yöntem nörolojiden kardiyopulmoner hastalığa kadar birçok tıbbi bilimsel araştırma alanında yararlı olabilir. Yöntemimizin PCR gösterimi önemlidir, çünkü geleneksel yayınla mümkün olmayan protokoldeki kritik adımların ayrıntılı bir şekilde sunulmasını sağlar.
PBiT vektörlerine ilgi genleri tanıtmak için astartasararak başlayın. Çoklu klonlama alanını bölen inframe stop kodonu nedeniyle, yönlü klonlama için gerekli olan iki benzersiz kısıtlama enziminden biri olarak üç bölgeden en az birini seçin. Bağlayıcı kalıntılarını kodlamak ve astarlara dahil etmek için nükleotid dizileri için el yazmasına bakın.
pBiT1.1-C ve pBiT2.1-C için ileri astar bir ATG kodonu ve güçlü bir Kozak konsensüs dizisi içerdiğinden emin olun. pBiT1.1-N ve pBiT2.1-N için ters astarın bir dur kodonu içerdiğinden emin olun. İlgi geninin kesici DNA'sını yükseltmek için tasarlanmış astarları kullanın.
PCR reaktiflerini el yazması yönlere göre birleştirerek mutasyonları en aza indirmek için yüksek kaliteli DNA polimeraz kullandığınızdan emin olun. Termocycler'ı programla ve reaksiyonu başlat. PCR tamamladıktan sonra, 50 mikrolitrelik sindirim reaksiyonu ürün sindirmek.
1,5 mililitrelik bir tüpte, 12 mikrolitre distile su, uygun 10X kısıtlamalı sindirim tamponunun beş mikrolitresi ve 30 mikrolitre PCR ürününü birleştirir. Sonra her bir restriksiyon enzim1.5 mikrolitre ekleyin. Girdap reaksiyon karışımı.
Ve bir gecede 37.5 santigrat derecede kuluçkaya yat. Alıcı plazmidsi sindirmek için ikinci bir reaksiyon hazırlayın. 1,5 mililitrelik bir tüpte, 23 mikrolitre su, uygun 10X kısıtlama lı sindirim tamponunun beş mikrolitresi, alıcı plazmidin 15 mikrolitresi ve her bir restriksiyon enziminin 1,5 mikrolitresini birleştirir.
Kısaca tüpü karıştırın. Ve bir gecede 37.5 santigrat derecede kuluçkaya yat. Klonlama ve dönüşümü takip eden gün, üç ila 10 ayrı bakteri kolonileri seçin ve ampisilin ile LB orta bir mililitre aktarın.
Hücreleri altı saat kuluçkaya yatırın. Ve sonra 200 mikrolitre bakteriyel süspansiyonu beş mililitre taze LB ortamına ampisilin ile aktarın. Bir gecede 200 rpm sallayarak 37,5 santigrat derece kültür kuluçka.
Ertesi gün, bir mini hazırlık DNA arıtma kiti ile plazmid izole. PCR ile başarılı ligasyon için saflaştırılmış plazmidi tarar. Transfeksiyondan bir gün önce, dulbecco'nun modifiye Kartal'ın orta sını kullanarak poli-L-lizin kaplı 96 kuyulu bir plaka üzerindeki hücreleri %10 fetal sığır serumu, mililitrede 100 adet penisilin G ve mililitre streptomisin başına 100 mikrolitre ile destekleyin.
Buharlaşmanın plaka ve kenar etkileri boyunca termal degradelerin potansiyelini en aza indirmek için 60 iç kuyuya sadece hücreler ekleyin. 36 dış kuyuya 200 mikrolitre steril distile su ve kuyular arasındaki boşluklara 150 mikrolitre ekleyin. Sonra tabağı bir gecede 37.5 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, toplam 100 nanogram DNA kullanarak transfeksiyon gerçekleştirin. El yazması talimatlara göre dört farklı plazmid kombinasyonu ayarlayın. Modifiye Eagle minimum temel medya 20 mikrolitre kullanarak HEPES ile tamponlu, ve iyi başına lipidik transfeksiyon reaktif 0.3 mikrolitre.
Her kuyuya 20 mikrolitre lipidik transfeksiyon reaktifi ve DNA karışımı ekleyin ve tabağı 10 saniye boyunca daireler halinde karıştırın. Plakayı 37.5 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle altı saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ortamı yenileyin.
Ve 24 saat daha kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, orta aspire ve her kuyuya HEPES ile tamponlanmış modifiye Eagle minimum temel medya 100 mikrolitre ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında 10 dakika stabilize olmasını bekleyin.
Bu arada, hücre kültürü ortamı ile karıştırmak için bir 5X stok oluşturarak, LCS seyreltme tampon 19 hacimli 100X substrat bir hacim birleştirerek furimazine substrat hazırlamak. Hücreler hazır olduğunda, her kuyuya 25 mikrolitre stok ekleyin ve plakayı 10 saniye boyunca hafifçe karıştırın. Daha sonra sinyal stabilizasyonu için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıldayan lığı ölçün.
Ligand ilavesi ile yapılan deneyler için, 13.5X ligand çözeltisini, HEPES ile tamponlanmış modifiye Eagle'ın minimum temel ortamına hazırlayın ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyubaşına 10 mikrolitre ekleyin. Sonra elle veya bir orbital shaker ile plaka karıştırın. Bu protokol, prototipitipik GPCR ile iki beta-arrestin izoform arasındaki etkileşimleri incelemek için başarıyla kullanılmıştır.
Dört farklı plazmid kombinasyonu tarandı ve daha sonraki deneyler için en yüksek Parlak sinyale sahip olan seçilmiştir. Her beta-arrestin izoform için EC50 değerleri, kinetik çalışmalardan her konsantrasyonun maksimum yanıtı ndan elde edilen doz-yanıt eğrileri kullanılarak belirlendi. PCR astarlarını tasarlarken özel dikkat etmek önemlidir.
Doğru yapılar geliştirilmesi bu tahlillerin başarısı için esastır. Bu metodolojiyi takiben, reseptör-beta-arrestin etkileşimlerini ve diğer sitosolik proteinlerile reseptör etkileşimlerini izleyebilirsiniz. Bu metodoloji, GPCR-beta-arrestin etkileşimlerinin ligand yapısındaki değişikliklerle nasıl modüle edilebildiğini inceleyerek GPCR farmakoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır.
