Bu protokol, kırmızı tümör hücresi sayımı ve klinik CTC izolasyonu için bir yöntem tanımladı. Başlamak için, MCF-7, MDA-MB-231 ve HeLa tümör hücrelerini bir hücre kültürü şişesinde bir milimetre DMEM'de bir kez 10 ila beşinci% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş olarak kültürleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
Hücre çizgileri% 95 birleşime kadar yapışkan tek tabakalar olarak büyüdüğünde, bunları iki dakika boyunca% 0.25 tripsin çözeltisi ile kültür kabından ayırın. Üç mikrolitre Calcein ekleyerek tümör hücrelerini boyayın ve tabağı 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüm hücreleri tripsin ile sindirin.
PBS'deki kültür tümör hücrelerini bir hücre sayma odası ile sayın ve bir mililitre PBS başına 100 tümör hücresi elde edilene kadar seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş hücre süspansiyonunu, çeşitli akış hızlarında bir şırınga pompalı bir şırınga kullanarak mikroakışkan çipe sokun. Çeşitli akış hızları için yakalama verimliliğini elde edin ve optimum akış hızını belirleyin.
Çip üzerinde yakalanan ve çıkıştan dışarı akan tümör hücrelerinin sayısını sayın. Verilen formülü kullanarak yakalama verimliliğini hesaplayın. 10'dan 100'e kadar farklı sayıda tümör hücresi için yakalama verimliliğini elde etmek için prosedürü tekrarlayın.
Nadir sayıda tümör hücresi için mikroakışkan çipi test edin ve doğrulayın. Seyreltilmiş tümör hücrelerini aspire etmek için bir mikropipet çektirmesi ile yapılan içi boş bir iğne kullanarak bu 10 numune süspansiyonunu mikroakışkan çiplere enjekte edin. Çip üzerinde yakalandıktan sonra her numune için tümör hücrelerinin sayısını tespit edin ve numaralandırın.
Daha sonra, tümör hücrelerini Calcein ile boyayın ve beş mikrolitre PBS'de 100 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri bir mililitrelik tam, normal kan örneğine dökün. Bu hücreleri çipe yerleştirin ve çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını yeşil immünofloresan ile numaralandırın.
Açıklandığı gibi in vivo numaralandırma gerçekleştirin ve yakalamadan sonra yakalama verimliliğini hesaplayın. Boyama olmadan bir ila 10 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri bir mililitre tam, normal kana dönüştürün.
Bu örnekleri mikroakışkan çipe yerleştirin ve tümör hücrelerini yakalayın. 20 ila 30 mikrolitre PBS'ye üç ila beş mikrolitre floresan boya ekleyin ve bu çözeltiyi bir şırınga ile çip üzerine verin. Yakalama verimliliğini belirlemek için çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını mavi ve yeşil immünofloresan ile numaralandırın.
Daha sonra, anti-epitelyal hücre adezyon molekülünün afiniteye dayalı yakalanması için çipin yüzeyini 100 mikrolitre% 4 3-merkaptopropil trimetoksisilan ve etanol ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca değiştirin. İnkübasyonun sonunda, çipi etanol ile üç kez yıkayın. Daha sonra 100 mikrolitre birleştirme maddesi GMBS ekleyin ve 30 dakika boyunca etkileşime girmesine izin verin.
İnkübasyonun sonunda, çipi bir mililitre PBS ile üç kez yıkamak için bir şırınga kullanın. Çipe, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında mililitre nötravidin başına 30 ila 40 mikrolitre 10 mikrogram uygulayın, bu da hücrelerin GMBS'ye immobilizasyonuna yol açar ve daha sonra fazla avidini çıkarmak için PBS ile yıkayın. Çipi üç mikrolitre anti-biyotinillenmiş epitel hücre adezyon molekülü antikoru ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin.
Tüm tümör hücreleri, herhangi bir hücre eksik olmadan dalga çipi dizisinin etrafında yakalandı, bu da mikroakışkan çipin yüksek yakalama verimliliğini gösterdi. Hoechst ve Calcein ile boyanmış tümör hücreleri burada gösterilmektedir. Küçük elips mikro filtreler kullanılarak yakalanan bir mide kanseri hastasından alınan CTC'ler burada gösterilmektedir.
Ayrıca, yamuk mikro filtreler kullanılarak yakalanan ve hem mavi hem de yeşil floresan yayan bir kolorektal kanser hastasından alınan CTC'ler gösterilmektedir. Büyük elips mikro filtreler kullanılarak yakalanan tümör hücreleri için yüksek yakalama etkinliği ve canlılığı gözlendi. Mikroakışkan çipte yakalanan kolorektal CTC'lerin klinik immünofloresan analizi, CTC'leri DAPI-pozitif, CK-pozitif, CD45-negatif ve WBC'leri DAPI-pozitif, CK-negatif, CD45-pozitif olarak tanıdı.
Yakalandıktan sonra büyük elips çip üzerinde kültürlenen kolorektal tümör hücreleri ve büyük elips mikro filtrelerde yakalanan kolorektal tümör hücreleri burada gösterilmektedir. Aptamer ile yapılan bu modifikasyon yöntemi, CTC izolasyonunu zenginleştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar.
