Bu protokolde kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri sekonder aderans yöntemi ile ekstrakte edilir. Kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri, osteoklastların in vitro çalışması için stabil bir hücre modeli sağlayan osteoklastlara başarılı bir şekilde farklılaşabilir. Bu yöntem küçük kemik iliği örnekleri için uygundur ve kemik iliği monosit-makrofaj hücrelerini kemik iliğinden yüksek teknoloji ürünü laboratuvar ekipmanı gerektirmeden basit ve hızlı bir şekilde çıkarabilir.
Osteoklastların artması osteoporozun potansiyel patogenezi olabilir. Kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri, osteoklast öncü hücreleri olarak belirli araştırma değerlerine sahiptir. Başlamak için, ötenazi sıçanları dezenfeksiyon için 10 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
Sıçanın tüm uzuvlarını makas ve forseps ile dikkatlice çıkardıktan sonra, bir pipet kullanarak PBS ile aspire edin ve uzuvlara yapışan kanı temizleyin. Daha sonra% 10 FBS DMEM'in iki mililitresinde beş mililitrelik bir tüpe dönüşür. Uzuv kemiklerini beş mililitrelik tüpe aktardıktan sonra, tüpteki uzuv kemiklerini küçük parçalara ayırmak için makas kullanın ve kemik iliği hücrelerini kültür ortamına geri püskürtmek için homojenatı karıştırın.
Doku parçaları tüpün dibine yerleşene kadar beş dakika bekletin. Daha sonra, 100 milimetrelik bir kültür kabına 10 mililitre% 10 FBS DMEM ekleyin ve ardından süpernatantı kültür kabına aktarın. Yaklaşık 24 saat boyunca% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bu kuluçka süresinden sonra, mezenkimal kök hücrelerin çoğunluğu kültür çanak duvarına yapışacak ve yavaş büyürken, çoğu kemik iliği monosit-makrofaj hücresi hala kültür ortamında asılı kalacaktır. 100 milimetrelik kültür kabındaki hücre süspansiyonunu yeni bir 25 santimetrekarelik şişeye aktarın ve hücreleri 24 saat daha% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede yetiştirmeye devam edin. Eski ortamı dikkatlice çıkardıktan sonra, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri şişe duvarına yapıştıktan sonra taze ortamla değiştirin.
Akım sitometrisi, monosit-makrofaj soy hücrelerinin yüzeyinde moleküler bir belirteç olan CD11b ve c'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesinin yaklaşık% 37.94 olduğunu gösterdi Sürekli hücre proliferasyonu ile, hücrelerin çoğunluğu düzensiz şekil içinde büyüdü ve radyal yapışkan bir diske dönüştü. TRAP boyama sonuçları, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, nükleer faktör kappa B ligandı reseptör aktivatörü ve makrofaj kolonisi stimüle edici faktör ile indüklenen hücrelerde hücre içi mor kırmızı granül sayısının anlamlı olarak arttığını göstermiştir. Western blot analizi, osteoklast spesifik proteinleri TRAP ve kathepsin K'nın ekspresyon seviyelerinin, tedavi edilen hücrelerde kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede arttığını göstermiştir.
Bu prosedürdeki en önemli şey, birincil kültürün 24 ila 48 saatinde sekonder yapışkan hücrelerin toplanma zamanıdır, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri tamamen yapışmaya başlar. Bu yöntemle izole edilen kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri, in vitro osteoklastlara indüklenebilir ve osteoporozun incelenmesi için stabil bir hücre modeli sağlar.
