Bu protokol, nükleik asit probları konusunda uzmanlaşmış olmayan araştırmacılar için bile uygulanması kolay bir metodoloji ile, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinin taranması için güçlü bir alternatif sunmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı, sonda-nükleaz dinamik etkileşiminden yararlanarak hem bilinen hem de bilinmeyen nükleaz aktivitelerini tanımlayabilen nükleik asit problarını seçebilme yeteneğidir. Bu metodolojinin diğer avantajları esnekliği, yüksek tekrarlanabilirliği ve kullanım kolaylığıdır.
Gösteri, Ustalık öğrencisi Hatice ve laboratuvarımızdan doktora sonrası barış tarafından gerçekleştirilecek. Bir oligonükleotid kütüphane tasarlarken, en az bir DNA ve adenin, guanin, sitozin ve tiamin veya urasil bir arada içeren bir RNA rasgele dizi içerir. Oligonükleotid probları hazırlamak için, liyofilize oligonükleotid probları aşağı spin ve çekirdek bozulmasını önlemek için mikrolitre konsantrasyonu başına 500 picomolar bir Tris-EDTA tampon her prob seyreltmek.
Katı ortamda bakteri kültürü için, tek bir gözenekli cam boncuk kriyojenik depolama doğrudan tsa içeren tek bir kültür çanak üzerine tek bir bakteri kolonileri dışarı çizgi defibrinated koyun kanı ile takviye rulo. Sonra 24 saat boyunca 37 santigrat derece plaka yerleştirin. Sıvı ortamda bakteri kültürü için, tek bir koloniyi katı bir orta kültürden 50 mililitre TSB'ye transfer edin ve dakikada 200 dönüşte 24 saat boyunca 37 derecede kuluçka için TSB'ye aktarın.
Ertesi gün, taze TSB bir ila 500 oranında kültür seyreltmek ve bir sallayarak kuvöz de 37 santigrat derece ve dakikada 200 rotasyonek 24 saat için bakteri kuluçka. Bir nükleaz aktivitesi analizi kurmak için, ilk önceden 37 santigrat derece bir florometre Sıcak ve dikkatle steril TSB veya supernatant 96 mikrolitre bir Salmonella veya E.Coli sıvı orta kültür den bir 1.5 mililitre nükleaz içermeyen mikrocentrifuge tüp prob başına ekleyin. Her tüpe dört mikrolitre prob çalışma çözeltisi ekleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen terek homojen çözümler elde edilene kadar her tüp içeriğini iyice karıştırmak için bir pipet kullanın.
Daha sonra, her çözeltinin 95 mikrolitresini siyah bir alt, arıtılmayan 96 kuyu plakasının duvarına yakın bir şekilde yükleyin ve kabarcıklardan kaçınmaya özen din. Tüm çözümler eklendiğinde, plakayı kapatın ve kapağı ölçüm yapıtlarına neden olabilecek kalem işaretleri veya toz lar için görsel olarak inceleyin. Nükleaz aktivite ölçümü için yazılım kurmak için uygun bir edinme yazılımı programı açın.
Görev Yöneticisi penceresinden Şimdi Oku'yu seçin ve kinetik ölçüm protokolünü oluşturmak için Yeni'yi seçin. 37 santigrat derece seçmek ve Tamam'ı tıklatarak ayarları onaylamak ve kaydetmek için Sıcaklığı Ayarla'yı tıklatın. Başlat Kinetik'i tıklatın. Açılan pencerede, ayarları onaylamak ve kaydetmek için Tamam'ı tıklatmadan önce Çalışma Zamanı giriş kutusunda iki saat ve aralık giriş kutusunda iki dakika seçin.
Oku'ya tıklayın. Açılan pencerede, Algılama Yöntemi olarak Floresan yoğunluğunu, Okuma Türü olarak Uç Kinetik'i ve Optik Türü olarak Filtreler'i seçin. Ardından Tamam'ı tıklatın. Açılan pencerede, Filtre Kümesi'nden Yeşil'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Yordam penceresinde, Kapağı Kullan'ı seçin ve Onu Doğrula'yı tıklatın.
Oluşturulan protokolün geçerli olduğunu onaylayan bir açılır pencere görüntülenir. Protokol menüsüaltında Yordam'ı seçin. Yordam penceresinde, ölçülecek kuyuları tanımlayın ve Dosya adı giriş kutusuna denemenin adını girin.
Daha sonra plakayı plaka okuyucusuna yükleyin, plakanın doğru yönde olduğuna dikkat edin ve satın almaya başlamak için Yeni Oku düğmesini tıklayın. Veri analizi için, verileri uygun analiz yazılımında açın ve plaka bir penceresinde ölçülen kuyulardan birini seçin. Wells'i seç'i tıklatın ve Tamam'ı tıklatmadan önce Ölçülen kuyuların tümünü Kuyu Seçimi İletişim penceresine ekleyin. Ardından, tablolanmış sonuçları görselleştirmek için bir numaralı plakadaki Veriler'i seçin ve verileri elektronik tabloya aktarmak için QuickExport'ı tıklatın.
Elektronik tabloda, veri sütunlarını her örnek ve sonda için uygun olarak etiketlendirin ve verilerin kinetik grafikler oluşturması için göreceli floresan birimlerini zamana göre çizin. Bu temsili deneyde, ilk tarama turundan sonra Salmonella kültürü süpernatants DNA sondaları üzerinde RNA probları için net bir tercih bildirdi. RNA'nın Salmonella nükleazları tarafından tercih edilen nükleik asit tipi olarak tanımlanmasına göre, taramanın ikinci turunda kullanılmak üzere yeni bir RNA kütüphanesi tasarlanmıştır.
Buna karşılık, E.Coli kültür orta kontrolleri RNA probları düşürmek için çok sınırlı bir yetenek gösterdi. RNA problarının özgüllüğünü artırmayı amaçlayan kimyasal olarak modifiye edilmiş nükleotitler kullanılarak yapılan ikinci bir taramadan sonra, RNA pirimidin 2'O-metil ve RNA püre 2'O-metil, kimyasal modifikasyonları temelinde, RNA pirimidin 2'fluoro ve RNA purine 2'fluoroile ile karşılaştırıldığında en iyi performans gösteren kinetik davranışı sergiledikleri için tanımlanabilir. Bu sonuçlar Salmonella özellikle bu bakteri tanıma yeteneğine sahip probları seçmek için kullanılabilecek diferansiyel substrat kimya tercihi ile önemli bir RNaAse aktivitesi olduğunu göstermektedir.
Bu prosedür, kanser veya bakteriyel enfeksiyon gibi hastalık koşullarıyla ilişkili nükleaz aktivitelerini belirleyebilen probların seçilmesini sağlayarak yeni klinik tanı araçlarının geliştirilmesine olanak sağlar.
