Bu çalışma aşağıdaki NIH hibeleri ile desteklenmiştir: NIH hibe R01EY031596 (CM'ye); NIH hibe R01EY029985 (CM'ye); NIH hibe P30EY010572 (CM'ye); NIH hibe R01EY032564 (BS'ye). Retina kesitlerinin hazırlanmasındaki teknik desteği için Tammie Haley'e ve bu çalışmada kullanılan mRNA FISH problarına cömertçe katkıda bulunduğu için Dr. Charles Allen'a teşekkür ederiz.

Murin bölünmüş retinada bipolar ve yatay nöronal hücrelerin incelenmesi

<ol>
	<li>Morgans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+ribbon+synapses+in+the+retina.">Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).</li><li>Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+bipolar+cells:+elementary+building+blocks+of+vision.">Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).</li><li>Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Cell+Feedback+to+Cone+Photoreceptors+in+Mammalian+Retina:+Novel+Insights+From+the+GABA-pH+Hybrid+Model.">Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li><li>Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+remove+photoreceptors+from+whole+mount+retina+in+vitro.">Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).</li><li>Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+retinal+preservation+in+the+photoinducible+I307N+rhodopsin+mutant+mouse,+a+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).</li><li>Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Ch&#233;dotal, A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+semaphorin+signaling+controls+laminar+stratification+in+the+mammalian+retina.">Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina.</a> Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).</li><li>Matsuoka, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance-Cue+Control+of+Horizontal+Cell+Morphology,+Lamination,+and+Synapse+Formation+in+the+Mammalian+Outer+Retina.">Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina.</a> Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).</li><li>W&#228;ssle, H., Puller, C., M&#252;ller, F., Haverkamp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+Contacts,+Mosaics,+and+Territories+of+Bipolar+Cells+in+the+Mouse+Retina.">Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina.</a> Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Cell+Types,+Circuits,+and+Mechanisms+for+Color+Vision+in+the+Vertebrate+Retina.">Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Todorova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Layer+Separation+(ReLayS)+method+enables+the+molecular+analysis+of+photoreceptor+segments+and+cell+bodies,+as+well+as+the+inner+retina.">Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).</li><li>Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+of+retinal+sublayers+from+the+entire+retina+with+special+reference+to+application+for+cell+culture.">A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).</li><li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre-recombinase+in+the+retina.">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li><li>Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermolecular+Interaction+between+Anchoring+Subunits+Specify+Subcellular+Targeting+and+Function+of+RGS+Proteins+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons.">Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).</li><li>Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphan+Receptor+GPR179+Forms+Macromolecular+Complexes+With+Components+of+Metabotropic+Signaling+Cascade+in+Retina+ON-Bipolar+Neurons.">Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).</li><li>Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Visualization+of+RNA+and+Protein+Expression+in+Tissue+Using+a+Combined+RNAscopeTM+In+Situ+Hybridization+and+Immunofluorescence+Protocol.">Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 2148, 301-312 (2020).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope.">RNAscope.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Morgans, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1+is+required+for+the+depolarizing+light+response+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).</li><li>Alessio, E., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+whole-mount+retinas+with+the+CLARITY+tissue+clearing+method.">Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).</li><li>Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Thickness+Normative+Data+in+Wild-Type+Mice+Using+Customized+Miniature+SD-OCT.">Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).</li><li>Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Protocol+for+Retinal+Wholemount+Preparation+for+Imaging+and+Immunohistochemistry.">Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).</li><li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+in+the+Retina.">Neurotransmitters in the Retina.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+functional+roles+of+horizontal+cells+in+the+retinal+circuit.">Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).</li><li>Egger, V., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A17+Amacrine+Cells+and+Olfactory+Granule+Cells:+Parallel+Processors+of+Early+Sensory+Information.">A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).</li><li>Dacey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+amacrine+cell.">The dopaminergic amacrine cell.</a> The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+analysis+reveals+an+interneuron+with+an+integral+role+in+the+retinal+circuit+for+night+vision.">Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision.</a> eLife. 9, 56077 (2020).</li><li>Janssen-Bienhold, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin57+is+expressed+in+dendro-dendritic+and+axo-axonal+gap+junctions+of+mouse+horizontal+cells+and+its+distribution+is+modulated+by+light.">Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+excitation+and+inhibition+in+the+dendrites+of+mouse+direction-selective+ganglion+cells.">The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells.</a> eLife. 9, 52949 (2020).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability,+affinity,+and+chromatic+variants+of+the+glutamate+sensor+iGluSnFR.">Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR.</a> Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).</li><li>Strauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Center-surround+interactions+underlie+bipolar+cell+motion+sensitivity+in+the+mouse+retina.">Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina.</a> Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+in+vivo+imaging+of+GABA.">A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA.</a> Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).</li><li>Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+Proton-Mediated+Inhibitory+Feedback+at+the+Retinal+Horizontal+Cell-Cone+Synapse+with+Genetically-Encoded+pH+Probes.">Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Fotoreseptörler foton absorpsiyonunu nörotransmitter salınımına dönüştürdükten sonra, BC'ler ve HC'ler görsel sinyali işleyen ilk retinal nöronlardır23. Bu nöronların önemi iyi takdir edilmekle birlikte, işlevlerinin çoğu tam olarak anlaşılmamış veya tamamen keşfedilmemiştir. Birçok BC ve HC fizyoloji çalışması, yanal bağlantıyı korurken INL nöronlarına erişimi iyileştiren düz montajlı bir retina preparatından faydalanabilir. Bölünmüş retina yönteminin geliştirilmesi, düz montaj oryantasyonunda BC'lerden ve HC'lerden yüksek kaliteli elektrofizyolojik kayıtlar ve mikroskopi verileri elde etmek için kolay bir protokol sağlama çabasını temsil eder. Burada tarif edilen bölünmüş retina hazırlığı, özel ekipman kullanılmadan retina izolasyonunu takiben fare başına yaklaşık 20 dakika (retina başına 10 dakika) içinde gerçekleştirilebilir. Yöntem, mevcut fotoreseptör çıkarma prosedürlerinden ilham alır, ancak basitlik, hız ve çok yönlülükte önemli gelişmeler sunar 4,10,11,12,13. Retina katmanlarını ayırmak için önceki yöntemlerin aksine, retina bölme, retinaya dondurulması, liyofilizasyon veya tekrar tekrar yapıştırıcı uygulanmasını gerektirmez. Uygulamada, neredeyse tüm fotoreseptörler nitroselüloz membran ile tek bir gözyaşı ile çıkarılabilir. Bu yaklaşımın hızı ve kolaylığı, retinanın karbojene Ames'ten geçirdiği süreyi en aza indirerek uzun süreler boyunca yüksek hücre canlılığı sağlar; bölünmüş retinalar, bölünmeden sonra birkaç saat boyunca karbojene Ames ortamında tutulabilir. Bu preparattaki INL nöronlarının sağlığının bir kanıtı olarak, bir canlı/ölü hücre boyası (Şekil 4) ve yama-kelepçe elektrofizyolojisi (Şekil 6), bir bölünmeyi takiben RBC'lerin ve HC'lerin yaşayabilirliğini doğrular.
Bölünmüş retinalarda fotoreseptör tabakasının çıkarılması, antikorların INL'ye difüzyon süresini önemli ölçüde azaltarak immünoişaretleme sırasında önemli bir avantaj sağlar. Birincil ve ikincil antikor etiketlemesi 2 saat içinde tamamlanabilir, bu da hedefe bağlı olarak 72 saat veya daha uzun sürebilengeleneksel düz montajlı boyamaya göre önemli bir gelişme 5,6,7,8,20,22. Sonuç olarak, mikroskopi verileri doku hazırlığı ile aynı gün elde edilebilir ve bu da immünofloresan deneylerinin hızını büyük ölçüde hızlandırır. mRNA prob tavlamasını kolaylaştırmak için, FISH deneyleri tipik olarak immünoetiketlemeden çok daha uzun fiksasyon süreleri (~ 24 saat) önerir18. Bununla birlikte, burada sunulan deneyler, 2 saatlik bir fiksasyonun hala istisnai FISH etiketlemesi ürettiğini göstermektedir (Şekil 5). Fiksasyon süresinin 30 dakikadan 2 saate uzatılmasına rağmen, mükemmel immüno-etiketleme elde etmek için antijen alma adımlarının gerçekleştirilmesi gerekli değildi, ancak bu antikor veya antijene göre değişebilir. FISH protokolündeki proteaz tedavisi, muhtemelen hedef epitopların yok edilmesi nedeniyle antikor etiketlemesine müdahale edebilir. Bu sorun, birden fazla epitopu hedef alan poliklonal antikorlar kullanılarak aşıldı ve epitop yıkımının immüno-etiketlemeyi engelleme olasılığını azalttı. Ek olarak, yeterli doku penetrasyonu sağlarken aşırı epitop değişikliğini önlemek için orta derecede bir proteaz tedavisi (ACD proteaz III) kullanıldı.
Bazen, retina bunun yerine dış nükleer tabakadan (ONL) bölünür ve INL hücreleri görünmeyen fotoreseptör soma katmanlarını geride bırakır. Bunu önlemek için, retinanın cam üzerinde tamamen düz durduğundan ve retinanın etrafındaki kalıntı sıvının çıkarıldığından emin olunmalıdır. Boya fırçası ile nitroselülozun üzerine daha sıkı bastırmak da ONL'den ayrılmayı önlemeye yardımcı olabilir. Zar çok ıslanırsa veya retina kendi üzerine katlanırsa, başarılı bir bölünme şansı büyük ölçüde azalacaktır. Hücre çekirdeklerini boyamak için DAPI kullanmak, bölünmenin kalitesini değerlendirmek ve kalan fotoreseptörlerin kapsamını belirlemek için yararlıdır. Fotoreseptör çekirdekleri daha küçük, daha parlak ve daha yüzeyseldir (Ek Şekil 3A), BC çekirdekleri ise daha büyük, daha sönük ve daha derindir (Ek Şekil 3B). Bazı durumlarda, yırtılma düzlemi retina parçası boyunca biraz değişecek ve bu da fotoreseptör hücre gövdelerinin tamamen çıkarılmadığı yamalara neden olacaktır (Ek Şekil 3C). Mikroskopi ve elektrofizyoloji uygulamaları için bu, fotoreseptörlerin uygun şekilde çıkarıldığı bölgelerden kaliteli veri toplama yeteneğini engellemez; Açıkta kalan iç retinanın geniş alanları, bir yama pipeti ile görüntüleme veya kayıt yaparken kolayca bulunabilir. Daha tam fotoreseptör çıkarılması isteniyorsa, ek bir nitroselüloz membran parçası ile ikinci bir yırtılma gerçekleştirilebilir, ancak %100 fotoreseptör çıkarılması garanti edilmez. Bu nedenle, artık fotoreseptör materyalinin sonuçları etkileyebileceği gen ekspresyonu veya proteomik çalışmalarda bölünmüş retinalar kullanılırken dikkatli olunması önerilir. Tek hücreli uygulamalar için, fotoreseptörlerden gelen veriler analizden çıkarılabileceğinden, bu endişe yersizdir.
Bölünmüş retina preparatının avantajları belki de en çok geniş alan internöronlarının elektrofizyolojik kayıtlarında belirgindir. Geleneksel dikey dilimler, geniş alanlı hücrelerin kapsamlı süreçlerini keserken, bölünmüş retina preparatı, OPL ve IPL'yi olduğu gibi bırakır ve HCs 24, A17s25, TH ACS 26 ve NOS-1 ACS27 gibi geniş alan hücrelerinden girdi yakalamaya izin verir. Bu nedenle, sonuçların yorumlanması ve retina dilimlerinden toplanan önceki verilerle karşılaştırılması dikkatli düşünmeyi gerektirir. Bununla birlikte, ışık stimülasyonunun farmakolojik taklitlerini kullanan deneylerde, bu sonuçlar retina dilimlerinden kaydedilen verilere benzemektedir19. ChR2'yi hücreye özgü promotörler altında eksprese ederek, istenen hücrenin dikey bilgi yolu üzerindeki etkisini araştırmak için INL'deki BC'lerden kayıt yaparken istenen bir hücre popülasyonu uyarılabilir. Amakrin hücreler gibi daha derin INL nöronlarından doğrudan kayıt, bölünmüş retinada da mümkündür. Bu durumda, yama elektrodunun önce daha yüzeysel INL nöronlarından geçmesi gerekirken, geleneksel bir tam montaj preparatına kıyasla yolunu tıkayan önemli ölçüde daha az doku vardır.
Bu yöntem, geniş alan hücrelerinin diğer nöronlar üzerindeki etkisini ölçmeye ek olarak, dendritleri OPL28'de geniş bir boşluk-bağlantı bağlantılı ağ oluşturan HC'lerden doğrudan tek hücreli yama klemplemesini sağlar. Yatay hücreler, retina yoluyla dikey bilgi iletimini şekillendiren fotoreseptörlere kritik geri bildirim gönderir. Bununla birlikte, HC'lerin dendritik alanları dikey dilimler halinde kesildiğinden, tek hücreli kayıt verileri eksiktir. Bu çalışma, ChR2 ile uyarılmış akımların üçlü bir transgenik fare hattında kaydedildiği anatomik ve fizyolojik olarak bozulmamış HC'leri sunmaktadır (Şekil 6 C-E). ChR2 stimülasyonunun dışında, bölünmüş retina endojen HC akımlarını ve boşluk bağlantı bağlantısı28'i incelemek için kullanılabilir. Bölünmüş retina, kimyasal uygulama veya ChR2 stimülasyonu ile indüklenen sinaptik bağlantı ve nöronal aktiviteyi incelemek için uygun bir model sağlarken, fotoreseptörlerin eksikliği, doğal ışık tepkilerinin veya ışık adaptasyon mekanizmalarının doğrudan araştırılmasını engeller.
Retinada in situ görüntüleme son yıllarda takdire şayan bir ilerleme kaydetmiştir. Bununla birlikte, görüntüleme çalışmalarının çoğu, tüm retina preparatlarında ganglion hücre tabakası ile sınırlıdır29. Yazarlar, bölünmüş retinada fotoreseptörlerin yokluğunun, onu OPL ve INL'de canlı kalsiyum görüntüleme için ideal bir model haline getireceğini öngörmektedir. Kalsiyum görüntülemenin ötesinde, bu model iGluSnFR30,31, iGABASnFR32 ve pHluorin 33 gibi genetik olarak kodlanmış biyosensörlerle kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir. Bölünmüş retina preparatı ile birleştiğinde, bu güçlü araçlar, retinada ışık işlemeye katkıda bulunan BC'lerin ve HC'lerin sinaptik etkileşimlerini ve biyofiziksel özelliklerini keşfetmek için etkili bir yaklaşım sunabilir.

Retina, ışığın yakalandığı ve beyin tarafından yorumlanabilen elektrokimyasal bir sinyale dönüştürüldüğü arka gözde bulunan ince bir sinir dokusudur. Retinanın arkasında, çubuk ve koni fotoreseptörleri ışıkla uyarılır, bu da nörotransmitterglutamat 1'in tonik salınım oranını azaltır. Glutamat konsantrasyonundaki bu ışığa bağlı değişikliği deneyimleyen ve buna yanıt veren ilk nöronlar, somaları iç nükleer tabakanın (INL) en dış bölgesinde bulunan bipolar hücreler (BC'ler) ve yatay hücrelerdir (HC'ler). Bu ikinci dereceden nöronlar, retinada sinyal işlemenin ilk aşamasını gerçekleştirir ve ışık adaptasyonu, kontrast duyarlılığı ve uzamsal/renk karşıtlığı gibi görüşün kritik özelliklerini şekillendirir2. Bu işlevler BC'lere ve HC'lere atfedilmiş olsa da, bu süreçlerin altında yatan devre ve biyokimyasal mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır3. Bu nedenle, BC ve HC fizyolojisini keşfetmek için araç ve yöntemlerin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır.
Dikey (enine) retina kesitleri, BC'leri ve HC'leri incelemek için en pratik model olduğunu uzun zamandır kanıtlamıştır; bununla birlikte, BC ve HC fizyolojisinin belirli yönlerine bu model altında deneyci tarafından erişilemez. HC'lerden doğrudan kayıtlar veya BC'ler üzerindeki etkilerinin dolaylı ölçümleri, bu hücrelerin lateral süreçleri dilimleme sırasında kesildiği için retinanın endojen bağlantısını yansıtmaz. Tüm retina preparatları, bu yanal süreçleri koruyarak bu sorunu ortadan kaldırır, ancak çevredeki retina katmanları bu hücrelere erişim için bir zorluk teşkil eder4. Tüm retina yuvasındaki INL nöronlarındanimmün boyama 5,6,7,8 ve yama klemp kayıtları9 ile ilgili çok sayıda örnek olsa da, bu verilerin toplanmasını hızlandırmak ve basitleştirmek için bir fırsat vardır. Enine kesitlerin doğal sınırlamaları ve tüm montaj modelinin zorlukları, bu alternatif düz montajlı retina preparatının geliştirilmesine ilham verdi.
Aşağıdaki çalışma, basitleştirilmiş yama klempleme ve daha hızlı, daha verimli immüno-etiketleme için BC'lere ve HC'lere erişimi geliştirmek için fotoreseptör tabakasını canlı, düz montajlı retinalardan kolayca çıkarmak için bir protokolü açıklamaktadır. İzole edilmiş bir retinanın her iki tarafına bağlı iki nitroselüloz membran parçasının soyulması, dokuyu fotoreseptör aksonları yoluyla yırtarak dış pleksiform tabakayı (OPL) ve tüm iç retina tabakalarını tutan bölünmüş bir retina bırakır. Diğerleri retinanın katmanlarını mekanik olarak ayırmak için protokolleri tanımlamış olsa da, bu yöntemler ya yama klempleme ve mikroskopi uygulamaları için uygun değildir ya da dokunun sıkıcı manipülasyonunu gerektirir. Bu yöntemlerin birçoğu, tabaka ayrımı için donmuş veya liyofilize doku gerektirir, bu da onları elektrofizyoloji deneyleriyleuyumsuz hale getirir 10,11,12. Diğerleri canlı doku için tasarlanmıştır, ancak fotoreseptörleri çıkarmak için filtre kağıdı 4,11 ile 5-15 ardışık peeling veya tripsin 13 ile tedavi gerektirir. Burada açıklanan teknik, fotoreseptör çıkarma prosedürünü basitleştirerek ve aşağı akış uygulamalarının repertuarını genişleterek öncüllerini geliştirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 pairs of Dumont #5 forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>38125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 gauge needle</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470 nm LED</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>M470L2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-306 curved scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; disposable pasteur pipetes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ai80d mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>25109</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:025109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium w/L-Glutamate</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A1372-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier control software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10.3 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-calbindin D28K antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA-5 85669</td>
			<td>RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612044</td>
			<td>RRID:&#160; AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GPR179 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4334</td>
			<td>RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PKC alpha antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc8393 AF594</td>
			<td>RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610495</td>
			<td>RRID:&#160; AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RGS11 antibody</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX;&#160; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin P38 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-S5768</td>
			<td>RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquamount mounting media</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>13800</td>
			<td>slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>000664</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:000664</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbogen tank</td>
			<td>Matheson</td>
			<td>NA</td>
			<td>95% O2 and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom transfer pipette</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitical optical power meter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>&#160;PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophysiology microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS, BX50WI</td>
			<td>Dodt gradient contrast microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 40x/1.3&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO CS2 63x/1.40&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Robbins Scientific</td>
			<td>Model 1000</td>
			<td>for RNAscope protocol only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immedge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td>66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe (delicate task wipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15506350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 X confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium 15 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25060-60</td>
			<td>eyes are kept here during retina dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merit 97-275 steel scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm-Gabrd-C2 mRNA probe</td>
			<td>ACD</td>
			<td>459481-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse euthanasia chamber</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>custom build; glass petri dish covering a small glass jar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane filters</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences; Whatman</td>
			<td>7184-005</td>
			<td>0.45 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>General Valve Corporation</td>
			<td>Picospritzer II&#160;</td>
			<td>referred to in the text as microcellular injection unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic transfer pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>for constructing custom transfer pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>R-603</td>
			<td>for connection to carbogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum harp</td>
			<td>custom build</td>
			<td>NA</td>
			<td>for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>size 0 paint brush</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>for flattening retina during splitting.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S36937&#160;</td>
			<td>referred to in the text as anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small 10 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>eyes are placed here following enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small glass pane (7.5 cm x 5 cm)</td>
			<td>generic</td>
			<td>NA</td>
			<td>isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>electrostatically-charged glass microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors; straight</td>
			<td>Titan Medical</td>
			<td>TMS121</td>
			<td>not brand specific; any comparable scissors will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGATFLPo mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>29591</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:029591</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGlut2Cre mouse</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>28863, 016963</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423105</td>
			<td>referred to in the text as MI-NIR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina

Omurgalı retinasının bipolar hücreleri ve yatay hücreleri, fotonlar fotoreseptörler tarafından tespit edildikten sonra görsel bilgiyi işleyen ilk nöronlardır. Işık adaptasyonu, kontrast duyarlılığı ve uzamsal ve renk kontrastı gibi temel işlemleri gerçekleştirirler. Davranışlarını yöneten kesin devre ve biyokimyasal mekanizmaların tam olarak anlaşılması, görsel sinirbilim araştırmalarını ve oftalmolojik tıbbı ilerletecektir. Bununla birlikte, bipolar ve yatay hücrelerin (retinal bütün bağlar ve dikey dilimler) incelenmesi için mevcut preparatlar, bu hücrelerin anatomisini ve fizyolojisini yakalama kapasitelerinde sınırlıdır. Bu çalışmada, fotoreseptör hücre gövdelerini canlı, düz montajlı fare retinalarından çıkarmak için bir yöntem sunuyoruz, verimli yama klempleme ve hızlı immüno-etiketleme için bipolar ve yatay hücrelere gelişmiş erişim sağlıyoruz. Bölünmüş retinalar, izole edilmiş bir fare retinasının iki parça nitroselüloz arasına sıkıştırılması ve ardından nazikçe soyulmasıyla hazırlanır. Ayırma, retinayı dış pleksiform tabakanın hemen üzerine böler ve biri fotoreseptör hücre gövdelerini ve diğeri kalan iç retinayı içeren iki parça nitroselüloz verir. Dikey retina dilimlerinden farklı olarak, bölünmüş retina preparatı, iç retinal nöronların dendritik süreçlerini kesmez, bu da boşluk bağlantısına bağlı ağların ve geniş alanlı amakrin hücrelerin katkılarını entegre eden bipolar ve yatay hücrelerden kayıtlara izin verir. Bu çalışma, elektrofizyoloji, immünohistokimya ve in situ hibridizasyon deneylerinde yatay ve bipolar hücrelerin incelenmesi için bu preparatın çok yönlülüğünü göstermektedir.

The retina is a thin neural tissue located in the posterior eye where light is intercepted and processed into an electrochemical signal that can be interpreted by the brain. At the back of the retina, rod and cone photoreceptors are stimulated by light, which reduces the tonic release rate of the neurotransmitter, glutamate1. The first neurons to experience and respond to this light-induced change in glutamate concentration are the bipolar cells (BCs) and horizontal cells (HCs), whose somas reside in the outermost region of the inner nuclear layer (INL). These second-order neurons perform the first stage of signal processing in the retina and shape critical features of vision such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial/color opponency2. While these functions have been ascribed to BCs and HCs, the circuitry and biochemical mechanisms underlying these processes are not fully understood3. Therefore, the advancement of tools and methods for exploring BC and HC physiology is of paramount importance.
Vertical (transverse) retina sections have long&#160;proven the most practical model for studying BCs and HCs; however, certain aspects of BC and HC physiology are inaccessible to the experimenter under this model. Direct recordings from HCs or indirect measurements of their effects on BCs do not reflect the retina&#39;s endogenous connectivity since the lateral processes of these cells are severed during slicing. Whole mount retina preparations circumvent this issue by preserving these lateral processes, but the surrounding retinal layers pose a challenge for accessing these cells4. While there are abundant examples of immunostaining5,6,7,8 and patch clamp recordings9 from INL neurons in whole mount retinas, there is an opportunity to expedite and simplify the collection of these data. The inherent limitations of transverse sections and the challenges of the whole mount model thus inspired the development of this alternative flatmount retina preparation.
The following work describes a protocol for easily removing the photoreceptor layer from live, flatmount retinas to enhance access to BCs and HCs for simplified patch clamping and faster, more efficient immunolabeling. Peeling apart two pieces of nitrocellulose membrane attached to either side of an isolated retina tears the tissue through the photoreceptor axons, leaving a split retina that retains the outer plexiform layer (OPL) and all inner retinal layers. While others have described protocols for mechanically separating layers of the retina, these methods are either poorly suited to patch clamping and microscopy applications or require tedious manipulation of the tissue. Several of these methods require frozen or lyophilized tissue for layer separation, making them incompatible with electrophysiology experiments10,11,12. Others are designed for live tissue, but necessitate 5-15 sequential peels with filter paper4,11 or treatment with trypsin13 to remove the photoreceptors. The technique described here improves upon its predecessors by simplifying the photoreceptor removal procedure and expanding the repertoire of downstream applications.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişim ve Hızlandırılmış Deneyler için Bölünmüş Retina Tekniğini Kullanma 

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Our group is interested in the neuronal circuitry and synaptic mechanisms underlying visual processing in the retina. The Morgans Lab is investigating molecular mechanisms of light adaptation in bipolar cells, and the Sivyer Lab is interested in how inner retinal neurons contribute to ganglion cell function. Accessing internuclear layer neurons in whole mount retina is a challenge for both anatomical and physiological studies.Internuclear layer neurons are accessible in vertical sections, but they're very few neurons in the field of view. Furthermore, slicing severs lateral processes and connections which can impact physiological studies. The removal of the photoreceptors in the split retina technique dramatically improves antibody diffusion into the inner retina, which makes immunolabeling of inner retinal targets over 20 times faster when compared to traditional whole mount retina.The split retina also greatly improves access to internuclear layer neurons during patch clamp electrophysiology. The split retina technique will open doors to new approaches and accelerate the pace of our experiments. For example, we plan to use this technique to study bipolar cell inputs to melanopsin ganglion cells by expressing channelrhodopsin in the bipolar cells.

Watch this Scientific Journal Video about Using the Split Retina Technique for Enhanced Access and Accelerated Experiments at JoVE.com

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by ...

Grubumuz, retinadaki görsel işlemenin altında yatan nöronal devre ve sinaptik mekanizmalarla ilgilenmektedir. Morgans Laboratuvarı, bipolar hücrelerde ışık adaptasyonunun moleküler mekanizmalarını araştırıyor ve Sivyer Laboratuvarı, iç retinal nöronların ganglion hücre fonksiyonuna nasıl katkıda bulunduğuyla ilgileniyor. Tüm retina dağındaki internükleer tabaka nöronlarına erişmek, hem anatomik hem de fizyolojik çalışmalar için bir zorluktur.Çekirdekler arası katman nöronlarına dikey bölümlerde erişilebilir, ancak görüş alanında çok az sayıda nöron bulunur. Ayrıca, dilimleme, fizyolojik çalışmaları etkileyebilecek yanal süreçleri ve bağlantıları keser. Bölünmüş retina tekniğinde fotoreseptörlerin çıkarılması, iç retinaya antikor difüzyonunu önemli ölçüde iyileştirir, bu da iç retina hedeflerinin immüno-etiketlemesini geleneksel tüm retina mount retinaya kıyasla 20 kat daha hızlı hale getirir.Bölünmüş retina ayrıca yama kelepçesi elektrofizyolojisi sırasında internükleer katman nöronlarına erişimi büyük ölçüde geliştirir. Bölünmüş retina tekniği yeni yaklaşımlara kapı açacak ve deneylerimizin hızını artıracaktır. Örneğin, bipolar hücrelerde channelrhodopsin eksprese ederek melanopsin ganglion hücrelerine bipolar hücre girdilerini incelemek için bu tekniği kullanmayı planlıyoruz.

split-retina-as-an-improved-flatmount-preparation-for-studying-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

1.9K Görüntüleme.  Oregon Health and Science University. Grubumuz, retinadaki görsel işlemenin altında yatan nöronal devre ve sinaptik mekanizmalarla ilgilenmektedir. Morgans Laboratuvarı, bipolar hücrelerde ışık adaptasyonunun moleküler mekanizmalarını araştırıyor ve Sivyer Laboratuvarı, iç retinal nöronların ganglion hücre fonksiyonuna nasıl katkıda bulunduğuyla ilgileniyor. Tüm retina dağındaki internükleer tabaka nöronlarına erişmek, hem anatomik hem de fizyolojik çalışmalar için bir zorluktur.Çekirdekl...

Video: Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişim ve Hızlandırılmış Deneyler için Bölünmüş Retina Tekniğini Kullanma 

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.