Bu protokol, pirinç dokularında PAMP uyarılması üzerine ROS üretimini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için optimize edilmiş bir L-012 tabanlı kemilüminesans yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem kolay, standartlaştırılmış ve sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullar altında yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan On Ying olacak.
Başlamak için, kabuğu çıkarılmış pirinç tohumlarını bir dakika boyunca% 70 etanol, daha sonra bir saat boyunca% 40 sodyum hipoklorit ile sterilize edin. Artık kloru gidermek için tohumları steril suyla beş kez durulayın. Pirinç kılıfı yönteminde, tohumları steril cam kapta doğrudan Murashige ve Skoog veya MS ortamı ile kaplayın.
Tohumları yaprak diski yönteminde kaplamak için, onları beş ila yedi gün boyunca MS plakalarına yapıştırın ve daha sonra büyüme matrisine veya toprağa nakledin. Fideleri 12 saat ışıklı, 12 saat karanlık fotoğraf periyoduna sahip bir büyüme odasında büyütün. 10 günlük pirinç fidelerinden kılıfı, ROS tahlilinden bir gün önce ön işlem için keskin bir tıraş bıçağı veya cerrahi bıçakla üç milimetrelik parçalara ayırın.
Beş kılıf segmentini, 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 96 kuyucuklu bir mikrotitrek plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin. Yaprak disklerini dört ila altı haftalık pirinç bitkilerinden bir pistonla biyopsi zımba kullanarak kesin. Veri varyasyonunu azaltmak için yaprak disklerini her zaman ana yeke makinesinin ikinci yaprağının orta üçte birinden kesin.
Daha sonra, bir yaprak diskini, ön işlem için 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su içeren 96 kuyucuklu bir mikrotitrek plakanın ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin. Yaprak tarafı ile ilişkili varyasyonları önlemek için tüm yaprak disklerini su ön arıtımı için bir mikrotiter plakasının kuyularında yüzer ve yukarı bakacak şekilde tutun. 9.4 mililitre 50 mikromolar Tris Hcl, 400 mikrolitre L012 çözeltisi, 100 mikrolitre at turpu peroksidaz ve 100 mikrolitre Flg22'yi birleştirerek ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın.
Kuyucuklara 200 mikrolitre çıkarma çözeltisi ekleyin. Yazılımı başlatın ve yeni bir protokol oluşturmak veya mevcut bir protokolü kullanmak için deneyler düğmesine tıklayın. Plakayı ayarlamak için açılır penceredeki prosedürü tıklayın ve izlenecek plakadan kuyucukları seçin.
Kinetik başlat'ı tıklatın ve deneysel gereksinimlere bağlı olarak çalışma zamanını 30 dakika veya daha uzun bir süreye ayarlayın. Okumaları mümkün olduğunca sık elde etmek için minimum aralığı seçin. Entegrasyon süresi için, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak bir saniye veya daha uzun bir süre seçin.
Ayarları onaylamak için doğrula'ya, ardından Tamam'a tıklayın, ardından açılır pencerede yeni plakayı algıla'ya tıklayın ve yazılımın yükleme plakası iletişim kutusunu sormasını bekleyin. Çift damıtılmış suyu, önceden işlenmiş dokuları içeren kuyucuklardan dikkatlice çıkarın, herhangi bir doku hasarını veya kurumasını önleyin. Dokuları içeren kuyucuklara 200 mikrolitre uyarma çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
Test edilecek plakayı taşıyıcıya yerleştirin ve algılamaya başlayın. Flg22 ile ROS'u indüklemek için yaprak diskler ve üç milimetre uzunluğunda kılıflar kullanıldı. ROS üretimi 35 dakika boyunca izlenir.
Çubuklar, beş teknik tekrardan hesaplanan standart sapmaların araçlarını gösterir. Pirinçte, ROS üretimindeki artış ilk olarak bir ila iki dakika içinde tespit edildi, 10 ila 12 dakikada zirveye ulaştı ve yaklaşık 30 ila 35 dakika içinde taban çizgisine geri döndü. Toplam ROS miktarı eğriden hesaplandı.
ROS değerlerinin toplam miktarını elde etmek için, oluşturulan toplam miktarı hesaplamak üzere formül toplamı uygulanarak birleştirilebilen her zaman aralığında oluşturulan ROS'u hesaplamak üzere formülü ilgili veri kümelerine uygulayın. Bir yaprak diskin tek bir deliği veya iki yarısı, 10 ila 12 saat boyunca 100 mikrolitre çift damıtılmış su ile önceden işlenmiş 96 kuyucuklu bir mikrotitrek plakanın kuyucuklarına yerleştirildi ve daha sonra ROS indüksiyonu için Flg22 ile muamele edildi. İki yarım disk örneğinden elde edilen okuma değerleri, tüm yaprak diskinden çok daha yüksektir.
Ortalama olarak, iki yarım disk örneğinden elde edilen toplam değerler, numunelerin alanıyla değil, kenar uzunluğuyla orantılı olan tüm yaprak diskinden neredeyse 1,6 katıdır. Bu sonuç, ROS'un esas olarak yara bölgesindeki hücrelerde üretildiğini desteklemektedir. Bu prosedürü denerken, dokularla nazikçe çalışın ve bir veri varyasyonunun kaynağı olabilecek ekstra kesikler yapmayın.
Bu yöntem, bitki dokularındaki diğer ROS üreten fizyolojik işlemlere uygulanabilir.
