Hücre dışı matris veya ECM sayısal hidrojel mikropartikülleri, iskele üretimi için yapı taşları olarak kullanılabilir. Bu protokol, jelatin metakriloil veya GelMA hidrojel mikropartiküllerinin üretimini, saflaştırılmasını, liyofilizasyonunu, fotoğraf montajını ve 3D biyobaskısını göstermektedir. GelMA, hücreye duyarlı ve öğretici bir biyomateryal olarak yaygın olarak kullanılan, hücre yapıştırıcısı ve biyobozunur parçaları içeren fotokimyasal, çapraz bağlanabilen, protein bazlı bir biyopolimerdir.
Geleneksel dökme hidrojel ile karşılaştırıldığında, GelMA granüler hidrojel iskeleleri mikro gözeneklidir ve yapı taşı boyutuna göre uyarlanabilen hızlı hücre infiltrasyonu sağlar. GelMA granüler hidrojel iskeleleri, ucuz platformlarda ve rejeneratif mühendislikte kalın dokuların, organların ve hastalıkların 3D biyobaskısı için yeni fırsatlar açabilir. Başlamak için,% 0.1'lik bir fotobaşlatıcı çözeltisi hazırlamak için 10 mililitre DPBS'ye 10 miligram LAP ekleyin.
Çözeltiyi alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun ve etiketleyin. Daha sonra, istenen miktarda GelMA'yı foto-başlatıcı çözeltisinde çözün. Net bir çözelti elde etmek için alüminyum folyo sarılı çözeltiyi bir saat boyunca 37 santigrat derece fırına yerleştirin.
Yağ fazını hazırlamak için, mühendislik sıvısında% 2 biyouyumlu bir yüzey aktif madde çözeltisi yapın. Tygon borusunu PDMS cihazının giriş ve çıkışlarına yerleştirin, ardından girişler için Tygon borusunun diğer ucuna 25 gauge künt bir iğne yerleştirin. Cihazı mikroskop altına yerleştirin ve bir saç kurutma makinesi veya bir alan ısıtıcı kullanarak ortamı yaklaşık 40 santigrat derecede sıcak tutun.
Sulu ve yağ çözeltilerini cihaza bağlı ayrı şırıngalara yükleyin. Yağ fazı için şırınga pompasını dakikada 160 mikrolitre akış hızıyla çalıştırın. Yağ kanalı doldurduktan sonra, sulu faza dakikada 80 mikrolitrede başlayın.
Mikroskop altında damlacık oluşumunu kontrol edin. Damlacıkları bir kapta toplayın ve optik mikroskopi görüntüleme ile görüntüleme odasında değerlendirin. GelMA mikrojelinin fiziksel çapraz bağlanmasını başlatmak ve damlacıkları kararlı mikrojellere dönüştürmek için damlacıkları gece boyunca dört santigrat derecede tutun.
Mikromühendislik ürünü emülsiyondan toza, MEtoP yöntemini uygulamak için, termal olarak dayanıklı mikrosantrifüj tüpleri veya kriyovyaller kullanarak mühendislik sıvısındaki fiziksel olarak çapraz bağlı mikrojelleri toplayın. Açık tüpü bir laboratuvar mendili ve bant ile kapatın. Liyofilizasyona devam etmek için fiziksel olarak çapraz bağlanmış mikrojelleri sıvı azot içinde 10 dakika boyunca derin dondurun.
Liyofilizasyondan sonra, katı bir toz elde edilecektir. Mikrojel süspansiyonları yapmak için liyofilize toza dört santigrat derecede bir mililitre soğutulmuş,% 0.1 fotobaşlatıcı çözelti ekleyin. Vorteksli karışımı 3.000g'da 15 saniye boyunca santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, paketlenmiş mikrojel süspansiyonunu pozitif deplasmanlı bir pipet kullanarak bir kalıba aktarın ve granüler hidrojel iskeleleri veya GHS oluşturmak için 60 saniye boyunca santimetrekare başına 15 miliwatt yoğunluğa sahip 400 nanometre dalga boyunda ışığa maruz bırakın. 400 mikrolitre mikrojel süspansiyonu için, fiziksel olarak çapraz bağlanmış GelMA mikrojellerine mühendislik sıvısında% 20 oranında eşit miktarda buz gibi soğuk PFO çözeltisi ekleyin. Daha sonra vorteksli karışımı 300g'de 15 saniye boyunca santrifüj edin ve yağ fazını pipetleme ile GelMA mikrojellerinden çıkarın.
Daha sonra mikrojel süspansiyonuna 400 mikrolitre buz gibi soğuk,% 0.1 fotobaşlatıcı çözelti ekleyin. Vorteksli çözeltiyi 15 saniye boyunca 300g'de santrifüj ettikten sonra, yağı atın. Fotobaşlatıcı çözelti ekleme ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın, ancak bu sefer 3.000g'da santrifüj yapın ve paketlenmiş GelMA mikrojellerinin süpernatantını atın.
Paketlenmiş GelMA mikrojellerini bir kalıba aktarın, ardından GHS'yi oluşturmak için ışığa maruz bırakın. % 3.33'lük bir nanopartikül dispersiyonu oluşturmak için üç mililitre buz gibi soğuk, ultra saf suya 100 miligram nanoplatelet tozu ekleyin. Agrega nanopartikülleri pul pul dökmek için dispersiyonu dört santigrat derecelik bir buzdolabının içinde 15 dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin.
Düzgün pul pul dökülmüş nanopartiküller net bir dağılım sağlar. % 1'lik bir fotobaşlatıcı stok çözeltisi hazırlamak için 50 miligram LAP'yi beş mililitre buz gibi soğuk, ultra saf suda çözün. Daha sonra pul pul dökülmüş nanopartikül dispersiyonuna 333 mikrolitre% 1 fotobaşlatıcı çözeltisi ekleyin ve ortam ışığına karşı korumak için alüminyum folyoya sarın.
Nanopartikül dispersiyonunu ve fotobaşlatıcıyı karıştırmak için karışımı bir dakika boyunca vorteksleyin. Fiziksel olarak çapraz bağlı GelMA mikrojellerine bire bir hacim oranında mühendislik sıvısında% 20 oranında buz gibi soğuk PFO ekleyin. Vorteksli karışımı 300 g'da 15 saniye boyunca santrifüj ettikten sonra, yüzey aktif maddeyi içeren yağ fazını atın.
Buz gibi soğuk, LAP takviyeli nanopartikül dispersiyonunu yıkanmış GelMA mikrojellerine ekleyin. 15 saniye boyunca 3.000g'da santrifüj yaptıktan sonra, altta kalan yağı ve süpernatant dispersiyonunu atın. JelMA nanomühendislik ürünü granül biyomürekkep veya NGB'yi elde etmek için bir gün boyunca alüminyum folyo kullanarak süspansiyonu dört santigrat derecede saklayın.
Ertesi gün, NGB'yi üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Yüklü şırıngayı bir kapak ve parafilm ile kapatın ve sıkışmış havayı gidermek için 200 g'da bir darbe santrifüjlemesi yapın. Dişi Luer kilit konektörünü kullanarak biyomürekkebi üç mililitrelik bir kartuşa aktarın.
Sıkışan havayı gidermek için kartuşu tekrar 200 g'da kısa bir süre santrifüj edin ve kullanmadan önce NGB'yi dört santigrat derecede tutun. Daha sonra, hazırlanan murin fibroblast hücre süspansiyonunu üç mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. NGB ve hücre yüklü şırıngaları dişi-dişi Luer kilit konektörü kullanarak birleştirin ve içeriği 40 kez ileri geri iterek hafifçe karıştırın.
NGB veya hücre yüklü NGB'yi, nozulu üç mililitrelik yazıcı kafasına yükleyerek standart konik nozullu uygun bir biyoyazıcı kullanarak yazdırın. Baskı yatağı sıcaklığını 10 santigrat derecenin altında tutun ve hız ve geri basınç gibi parametreleri optimize edin. İstediğiniz gcode veya STL dosyasını seçin.
Ardından, standart bir konik nozul ile donatılmış pnömatik üç mililitrelik bir şırınga için substratı ve nozul tipini seçin. Aygıt yönergelerini kullanarak biyoyazıcıyı kalibre edin ve 3B yapıları elde etmek için yazdırmaya başlayın. MEtoP teknolojisi, mikrojelleri agregasyondan ve ciddi deformasyondan korurken, düşük basınçlı dondurarak kurutma ile yeniden askıya alınabilir kurutulmuş mikrojel tozu elde etti.
SEM görüntüleri, bu teknolojiyi kullanan kurutulmuş GelMA mikropartiküllerinin, geleneksel liyofilizasyon ile gözlenen agregasyona kıyasla, liyofilizasyondan sonra küresel şekillerini koruduğunu göstermiştir. GelMA, GHS ve NGB'nin yüksek moleküler ağırlıklı floresan boya ile mikropor karakterizasyonu, birbirine bağlı mikro ölçekli boşluk boşluklarını gösterdi. Ayrıca, özel olarak yazılmış bir MATLAB komut dosyası kullanılarak değerlendirilen floresan görüntüsü gözenekleri tespit etti.
Boşluk fraksiyonu ve medyan gözenek eşdeğeri çap ölçümleri, NGB'yi kullanan 3D baskılı iskelelerdeki mikro ölçekli gözeneklerin kullanılabilirliğini ve birbirine bağlanabilirliğini kanıtlayan anlamlı bir fark göstermedi. NGB iskelelerinin asılı filament uzunluğu ölçümü ile sıkıca ve gevşek bir şekilde paketlenmiş GelMA mikrojellerine üstünlüğü, NGB'nin paketlenmiş mikrojellerden daha uzun bir uzunluğa sahip olduğunu ortaya koymuştur. Gevşek paketlenmiş mikrojeller filament vermedi.
İçi boş bir silindir 3D baskılıydı ve tüm yapı fotoçapraz bağlantı için ışığa maruz bırakıldı. Basılı yapı, şekli, doğruluğu ve yapısal bütünlüğü göstermek için fiziksel olarak tutuldu. İskele biyolojik değerlendirme için, örneğin hücre yüklü biyobaskıda kullanılıyorsa, tüm adımları belirli koşullar altında, biyolojik güvenlik kabini altında gerçekleştirmeyi unutmayın.
Granüler hidrojel iskelelerin biyotıpta yeni ortaya çıkan bir biyomateryal platformu olarak kullanımını pazardan çıkarmayı umuyoruz.
