Bu protokol, mikro gözenekli iskelelere birbirine bağlanan mikro jel çubukların imalatını açıklamaktadır. Bu iskeleler, verimli hücre hücresi etkileşimi için gerekli alanı sağlayan hücrelerle kombinasyon halinde kullanılabilir. İki farklı tipte mikro jel çubuk temas halinde birbirine bağlanır.
Yüksek en-boy oranında, küresel mikro jellere kıyasla daha az sentetik malzeme kullanarak iskele stabilitesini korurken daha büyük gözeneklere yol açar. Mikrogözenekli iskeleler, hasarlı dokuyu onarmak için endojen hücrelerin infiltrasyonunu ve etkileşimini önemli ölçüde artıracaktır. Büyük gözenekler, besinleri büyüyen dokuya değiştirmek için kan damarı oluşumunu kolaylaştıracaktır.
İskele malzemesinin azaltılması, hem in vitro hem de in vivo uygulamalar için önemli olan doku oluşumu için daha fazla açık alan sağlandığı için faydalıdır. Kritik bir husus, çipülasyon tekniğindeki mikrofitiktir. Mikro jel çubukların sürekli üretimini sağlamak için, ürün tıkanmadan tüpün dışına etkili bir şekilde taşınmalıdır.
Başlamak için, iğneleri polietilen tüplere yerleştirin ve gazı şırıngadan ve tüpten çıkarın. Ardından, ürün toplama için çıkışa ek bir polietilen tüp yerleştirin. Ardından, tüm cam şırıngaları ve şırınga pompalarını yerleştirin ve her boru ucunu ilgili girişe yerleştirin.
Ardından, mikroskopu yağlı su kesitine odaklayın. Dağınık fazda kanalın ıslanmasını önlemek için kanalı önce yağ ile doldurmak için ilk yağ şırınga pompasını çalıştırın. Daha sonra, ilk yağ akış hızını saatte 30 mikrolitreye düşürün ve enine kesitte dağılmış sulu faz gözlemlenene kadar prepolimer şırınga pompasını çalıştırın.
Ardından, ön polimer akış hızını saatte 30 mikrolitreye ayarlayın ve mikroskobu çıkışa odaklayın. Ardından, ikinci yağ şırınga pompasını çalıştırın ve akış rejimi stabil olana kadar bekleyin. Çıkış tüpünü bir toplama kabına yerleştirin ve UV ışınlama sistemini, ışımanın santimetre kare başına 900 ila 1000 mili watt aralığında olacağı şekilde ayarlayın.
Ve ışınlama noktası, çıkıştan önceki düz kanal kısmıdır. UV ışınlamasından önce, 3.0 ila 4.5 aralığında istenen en boy oranını elde etmek için ön polimerin ve ilk yağın akış hızlarını ayarlayın ve ışınlama noktasının boyutuna bağlı olarak dağılmış fazın ışınlama süresini yaklaşık 2.3 saniyeye ayarlayın. Ardından UV ışınlamasına başlayın ve gerekirse akış hızlarını önceki alt bölüme göre tekrar ayarlayın.
Ardından, koleksiyon kapsayıcısını değiştirin ve ürün koleksiyonu başlangıç saatini ve akış hızlarını not edin. Koleksiyonu sonlandırmak için, saati belirten koleksiyon kapsayıcısını kaldırın. Daha sonra, ışınlamayı ve tüm şırınga pompalarını durdurun.
Daha sonra ürünü her biri beş kez n-Hekzan, izopropanol ve deiyonize su ile yıkayın. Daha sonra çubuk çökelmesinden sonra süpernatantı çıkarın. İlk bileşen dağılımını konik 1.5 veya iki mililitrelik şeffaf bir şişeye aktarın.
Ardından, ikinci bileşeni kontrollü bir şekilde 100 mikrolitrelik bir pipetle sürekli bir işlemle ekleyin ve sıvı almak için pipeti kullanarak içeriği doğrudan karıştırın ve tekrar ekleyin. Daha sonra, kalan tüm epoksi gruplarını serbest amin ve thyal taşıyan hücre yapışkan peptidi ile değiştirmek için birbirine bağlı yapıya G R G D S P C çözeltisi ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, reaksiyona girmemiş molekülleri deiyonize suyla yıkayarak çıkarın ve süpernatanı çıkarın.
Su seviyesini düşürdükten sonra, şişeyi açın ve dalga boyundaki UV ışığıyla, 250 ila 300 nanometre ile ışın. Sonra şişeyi kapatın ve şişeyi temiz bir tezgaha aktarın. Daha sonra steril suyla yıkayın.
Şişedeki suyu hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve beş dakika boyunca dengeye izin verin. Daha sonra, makro gözenekli iskeleyi bir spatula dökerek veya kullanarak deney için bir hücre kültürü kuyu plakasına aktarın. Konfokal mikroskopi, 3D makro gözenekli yapının birbirine bağlı amin ve epoksi işlevselleştirilmiş mikro jel çubuklardan oluştuğunu ortaya koydu.
Yapı, iki veya üç saniye içinde oluşturulan yaklaşık 10.000 mikro jel çubuktan oluşan kompakt bir geometri sergiliyor. Effective Young'ın amin ve epoksi mikro jel çubuklarının modülü ile birlikte amin ve epoksi mikro jel küreleri nano girinti ile ölçülür. Aktif fonksiyonel grupları tespit etmek için, floresein iso tiyosiyanat, birincil amino gruplarını görselleştirmek için kullanılabilir ve epoksi gruplarını etiketlemek için floresein amin izomeri kullanılabilir.
Amin mikro jel çubuklar, deiyonize suda ortalama uzunluğu 553 mikrometre ve ortalama genişliği 193 mikrometre olan boyutlara sahiptir ve bu da yaklaşık 3.0 en boy oranına neden olur. Makro gözeneklerin ve mikro jel çubuklardan oluşan iskelelerin ortalama değerleri 100 mikrometredir ve gözenek boyutlarının %90'ı 30 mikrometreden 150 mikrometreye kadar değişmektedir. Mikro jeller gibi küre, gözenek boyutları yaklaşık 10 ila 55 mikrometre arasında olan ve ortalama değeri yaklaşık 22 mikrometre olan kümelerle sonuçlanır.
Tanımlanan mikro jel çubuklar, rastgele karıştırma ile birbirine bağlı mikro gözenekli iskeleler üretmek için tasarlanmıştır. Kontrollü bir karıştırma prosedürü, gelecekte daha özel iskele geometrilerinin üretilmesine izin verebilir. Mikro jellerin sertliği ve biyokimyasal ipuçları, satış gereksinimlerine göre değişebilir.
Farklı yapı taşlarını birleştirerek, bir iskele içinde çok çeşitli geometriler ve özellikler elde edilebilir. Bu şekilde, çok hücreli dokular oluşturmak için belirli hücreleri verimli bir şekilde hedefleyebiliriz.
