Yöntem nispeten basittir ve rhesus makak B hücrelerinin etkili gen düzenlemesine izin verir. Yöntem, rhesus makaklarında terapötik amaçlar için gen düzenlenmiş B hücrelerinin test edilmesine izin verir. Ayrıca klinik öncesi B hücre tedavisi araştırmaları için de uygundur.
Genel yöntem diğer hücre tipleri için uyarlanabilir. Prosedür doğru bir şekilde takip edilirse, mücadele beklenmemelidir. Bununla birlikte, gRNA kesme verimliliği ve rekombinant AAV6 sağlayan şablonun kaliteli bir partisi kritik öneme sahiptir.
Başlamak için, B hücre kültürü ortamını 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın. B hücresi uyarıcılarını buz üzerinde çözün. Önceden ısıtılmış bir çözme ortamı içeren uygun boyutta bir tüp hazırlayın.
37 santigrat derecelik bir su banyosunda bir ila iki şişe birincil rhesus makak splenositini veya PBMC'yi çözün. Splenositleri, önceden ısıtılmış bir çözme ortamı içeren hazırlanmış tüpe boşaltın. Tüm hücreleri toplamak için kriyotüpleri durulayın.
Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 G'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücreleri yıkama için 10 mililitre çözme ortamında yeniden askıya alın. Dondurucu ortamı çıkarmak için santrifüjlemeleri üç kez tekrarlayın.
Son santrifüjlemeden sonra, hücreleri bir B hücre kültürü ortamında mililitre başına altı hücreye tahmini beş kez 10 ila yeniden askıya alın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi ile birleştirin ve bir hemositometredeki hücreleri sayın. Hücre konsantrasyonunu, hücre sayısına göre B hücre kültürü ortamı ile mililitre başına altı hücreye üç kez 10'a ayarlayın.
Ardından, B hücresi uyarıcılarını son konsantrasyonlarına ekleyin ve karıştırın. Hücreleri bir hücre kültürü kabına aktarın ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Yerleştikten sonra, hücreler yoğun bir tek katman oluşturmalıdır ve küçük hücre kümeleri zaten görülebilir.
Yaklaşık iki gün sonra, hücreler sağlıklı, düzensiz olmalı ve gözle görülür şekilde daha büyük kümeler oluşturmalıdır. B hücrelerini aktive ettikten sonra, reaktifleri elektroporasyon ve transdüksiyon için hazırlayın. DMSO nükleaz içermeyen dubleks tampon, tampon T ve tampon E veya E2'yi elektroporasyon kitinden oda sıcaklığına önceden ısıtın.
rAAV6 homolojiye yönelik onarım şablonunu veya HDRT ve B hücresi uyarıcılarını buz üzerinde çözün. CRISPR Cas9 tek kılavuzlu RNA'yı veya sgRNA'yı dubleks tamponda 100 mikromolar'da yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yeniden oluşturun ve vorteks ve titreşimle karıştırın.
Yeniden yapılandırılmış sgRNA'yı kullanılıncaya kadar buz üzerine yerleştirin. 10 mikrolitrelik elektroporasyon için, uyarıcılar ve% 1 DMSO ile 550 mikrolitre B hücre kültürü ortamı hazırlayın. Bu ortamın 50 mikrolitresini antibiyotikli veya antibiyotiksiz olarak 48 delikli bir hücre kültürü plakasına ekleyin.
Ardından, kuyulardaki ortama, kuyunun hacminin% 20'sine kadar rAAV6 HDRT ekleyin. Hazırlanan yemeği ve kalan ortamı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde önceden ısıtın. Daha sonra, 10 mikrolitrelik elektroporasyon için, dubleks tamponda 0.4 mikrolitre 61 mikromolar Cas9 ile 0.75 mikrolitre 100 mikromolar sgRNA'yı karıştırarak 1.15 mikrolitre ribonükleoprotein veya RNP hazırlayın.
RNP'yi hücrelerle karıştırmadan önce oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, aynı anda birden fazla lokus hedeflenecekse birden fazla RNP birleştirilebilir. Ardından, hücreleri elektroporasyon için hazırlayın.
Sıcaklık şoklarını önlemek için hücreleri oda sıcaklığında bırakın. Kuluçkadan sonra, hücreleri uygun bir kaba toplayın. Maksimum hücre sayısını toplamak için kabı DPBS ile durulayın.
Hücreleri 200 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve DPBS'deki hücreleri, kültüre yerleştirilen hücre sayısına bağlı olarak, mililitre başına yaklaşık iki kez 10 ila altı hücreye yeniden askıya alın. Eşit hacimlerde hücre süspansiyonu ve% 0.4 tripan mavisini birleştirin ve bir hemositometre kullanarak sayın.
Süpernatanı santrifüj ettikten ve attıktan sonra, hücreleri hücre sayısına bağlı olarak önceden ısıtılmış tampon T'de mililitre başına yedi hücreye 5.55 kez 10'da yeniden askıya alın. Makineyi açıp 1.350 volt, 15 milisaniye ve bir darbeye ayarlayarak transfeksiyon sistemini kurun. Pipet istasyonunu laminer akış davlumbazının içine yerleştirin.
Her 10 elektroporasyon seti için, üç mililitre tamponlu bir transfeksiyon tüpü hazırlayın E.Tüpü pipet istasyonuna yerleştirin. 1.15 mikrolitre RNP'yi elektroporasyon başına dokuz mikrolitre hücre ile birleştirin. Kabarcıkları önlemek için en az% 20 daha fazla hazırlayın ve elektroporasyondan önce bir dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
10 mikrolitre RNP ve hücre karışımını bir elektroporasyon pipeti üzerindeki elektroporasyon ucuna aspire edin. Yüklenen pipeti pipet istasyonuna takın ve elektroporasyonu başlatın. Arklanmayı önlemek için uçların tamamen hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun.
Elektropore edilmiş hücreleri derhal 48 kuyucuğun içinde, rAAV6'lı veya rAAV6'sız hazırlanmış önceden ısıtılmış küçük hacimli ortama çıkarın. Kültür kuyularına transfeksiyon olmadan kontrol numuneleri ekleyin. Hücreleri dört ila altı saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, plakaya uyarıcılar, DMSO ve antibiyotikli veya antibiyotiksiz 450 mikrolitre önceden ısıtılmış B hücre kültürü ortamı ekleyin. 24 saat sonra genomik DNA analizi yapın. Homoloji kolunun dışında bir astar ve kesici ucun içinde bir astar kullanarak dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR ile düzenleme verimliliğini ölçün.
Ekleme bölgesini yükseltmek için PCR ve doğru düzenlemeyi doğrulamak için Sanger dizilimini gerçekleştirin. Protein seviyelerini analiz etmek için, protein ekspresyonunun değişmesine izin vermek ve akış sitometrisi ile bir analiz yapmak için elektroporasyondan sonra hücreleri 40 ila 48 saat boyunca kültürleyin. Tetrasiklin etkin, kendi kendini susturan adenoviral yardımcı kullanılarak rAAV6 üretimi, mililitre hücre kültürü ortamı başına dört kat 10 ila 10 GC üretimi ile sonuçlandı ve yardımcısız üçlü transfeksiyon kullanarak üretimden 30 ila 40 kat daha iyi performans gösterdi.
İsteğe bağlı saflaştırma, CD3 + T hücrelerinin ve CD14 + ve CD16 + miyeloid hücrelerin çoğunun elimine edilmesiyle sonuçlandı ve% 80 ila% 95 CD20 + B hücrelerinin saflıkları rutin olarak elde edildi. Primer rhesus makak B hücrelerinin gen düzenlemesi burada gösterilmiştir. Bu çalışma, yüksek hücre canlılığını korurken, aynı zamanda% 80 B hücrelerindeki hafif zincir ekspresyonunu da siler.
B hücrelerinin çoğunluğu hala izotip IgM eksprese etti. Antikor 1485 HDRT'yi kodlayan rAAV6'nın eklenmesi, antikor zincirleri için düzenlenmemiş B hücrelerine göre daha düşük floresan yoğunluğunda olmasına rağmen, B hücrelerinin% 16 ila% 21'inde gen düzenleme ve antikor 1485 yüzey ekspresyonu ile sonuçlandı. %1 DMSO eklenmesi ve rAAV6 HDRT ile genişletilmiş, konsantre inkübasyonlar genellikle düzenleme verimliliğini artırdı.
Bu yöntem kullanılarak, bireysel rhesus makakına ve rAAV6 HDRT partisinin kalitesine bağlı olarak tipik olarak %beş ila %20 ve %40'a kadar düzenleme verimliliği elde edildi. Elektroporasyonu gerçekleştirirken, transfeksiyon için yeterli karışıma sahip olduğunuzdan ve uçta kabarcık olmadığından emin olun. Hücreler istenilen herhangi bir yöntemle analiz edilebilir veya donör rhesus makakına otolog transfer yapılabilir.
