Lokus coeruleus disfonksiyonu nörolojik ve nöropsikiyatrik bozukluklar, Parkinson hastalığı dahil olmak üzere, Alzheimer hastalığı, depresyon, bipolar bozukluk, ve anksiyete karıştığı olmuştur. Bu roller göz önüne alındığında, locus coeruleus analizi fonksiyonu ve disfonksiyon çalışma için çok önemlidir. Fare beyin kesiti sırasında, lokus coeruleus kolayca küçük boyutu nedeniyle koronal veya sagital kesitlerde cevapsız olabilir.
Bu nedenle, locus coeruleus lokalizasyonu için rehberlik sunmak için, biz çeşitli uygulamalar için fare beyninde bu bölgeyi bulmak için geliştirilen bir protokol açıklar. Anestezive sonra 50 mililitrelik bir tüp% 4 PFA içinde fare perfüzyon taze izole beyin yerleştirerek başlayın. Beyni 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Beyni %30 sakaroz çözeltisinin 25 mililitrelik kısmıyla dolu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için forseps kullanın. Beyin tüpün dibine batana kadar 48 ila 72 saat boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın. Beyin sapı bölümünü yerleştirmek için, kesme yüzeyini gömme kalıbının altına yerleştirin ve beyin sapını çevreleyen optimum kesme sıcaklık bileşiği ekleyin.
Gömülü beyni eksi 80 derecelik bir dondurucuda en az 12 saat daha fazla kullanılana kadar dondurun. Kriyostat içine beyin ile kalıp yerleştirin ve kriyostat bu sıcaklığını ayarlamak için birkaç saat kuluçka. Beyni içeren OCT bloğunu ortaya çıkarmak için, kalıbın dört kenarını dibe kadar kesmek için bir jilet kullanın ve sonra kalıbı soyun.
Kalire dokunmamak için blok yüzeyinden OCT fazlalığını kaldırmak için jilet kullanın. Sonra kriyostat chuck OCT blok monte, ön doğru beynin kesik yüzeyi açığa. Beyni ayarlamak için, kesilmiş yüzeyi kriyostat'ın jiletlerine paralel olarak yönlendirin.
Numuneyi düzgün bir şekilde yönlendirmek bu protokolde çok önemli bir adımdır. Beyincik ve inferior kolikulus arasındaki sınır gibi LC'yi bulmak için beynin dorsal yüzeyinin anatomik özelliklerini kullandığımız için, kesitlerin düzgün bir şekilde hizalanmış olması önemlidir. Bu düzgün fare beyin dilimleyici matris içine beyin ayarı bakım gerektirir.
Beyni medulladan başlayarak 100 mikrometrelik kesitleri kes. Beyincik ve beyin sapı dördüncü ventrikül seviyesinde sürekli bir dilim olarak kesmeye başladıktan sonra, 50 mikrometre kalınlığında dilim toplamaya başlar. Her beyin dilimitoplamak ve PBS ile dolu 24 kuyulu bir tabak içinde yerleştirmek için forceps kullanın.
Lokus coeruleus en çok serebellum ve inferior kolikulusun birbiriyle buluştuğu bir dilimde hissedilir. İlk gün, 24 kuyulu plaka üç kez beş dakika her PBS beyin dilimleri yıkayın. Daha sonra deterjanla %0.5 PBS ekleyin ve 24 saat boyunca dört derece santigrat derecede geçirin.
Ertesi gün, dilimleri her biri %0,5 PBSD ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra 0,5% PBSD bir ila 500 seyreltme ve 18 saat boyunca dört derece santigrat de kuluçka birincil antikor ekleyin. Üçüncü gün, dilimleri her biri %0,5 PBSD ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve %0,5 PBSD'de 1ila 1000 arasında seyreltme de ikincil antikor ekleyin.
16 saat boyunca dört derece santigrat de alüminyum folyo ve kuluçka ile plaka sarın. Kuluçkadan sonra dilimleri her biri %0,5 PBSD ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından PBS'de beş dakika yıkayın. DAPI olmadan sert montaj ortamı kullanarak bölümleri kaplayın.
Bir cam kapak ile kapak ve oda sıcaklığında 30 dakika kuru. Daha sonra, uygun floresan dalga boyundan görüntü beyin dilimlerine gelen sinyali tespit etmek için ayarları olan bir konfokal mikroskop kullanın. Mikroskobu beyin diliminin odak düzlemine ayarladıktan sonra, tek bir görüntü almak için 10 kat büyütme kullanın.
Beyin sapı altında bulunan dördüncü ventrikül kullanın ve pons ve beyin sapı üzerinde beyin dilimi olası bir LC bölge bulmak için. Dördüncü ventrikül lateral kenarlarına odaklanmak ve LC dördüncü ventrikül kenarlarından başlayarak ve pons beyin sapı bölgeye doğru işaret yer alacak. LC'de ifade edilen bir protein olan dopamin beta-hidroksilaz'ın hücre içi dağılımı, LC morfolojisi ve nöronal yoğunluğu incelemek için bu protokol kullanılarak değerlendirildi.
LC ifade başka bir protein, tirozin hidroksilaz, ayrıca metal homeostaz LC.Changes içeren beyin dilimlerinde güçlü bir yeşil floresan sinyal gösterdi genellikle nörolojik bozukluklar gözlenen, bu örnekte LC.In değişiklikler de dahil olmak üzere, LC ile kesilmiş bir beyin dilimi fosfat için ölçüldüğünde, potasyum, çinko, ve bakır, sadece bakır sinyal belirli bir artış gösterdi. Çekirdeğin eksik olmasını önlemek için yaklaşık 500 mikron daha fazla doku ön ve lc posterior kesmenizi ve özellikle bu protokolü ilk kez yerine getirirken gerekenden daha fazla kesit kesmenizi öneririz. Boyama önce beyin atlası görüntüleri dikkatli çalışma çok yararlıdır.
LC immünohistokimya ile bulunduğunda, komşu beyin dilimleri morfolojik ve metabolik analiz ler ve x-ışını floresan mikroskobu ile metal görüntüleme çalışmaları da dahil olmak üzere ileri çalışmalar için kullanılabilir. Açıklanan protokol kullanılarak oluşturulan beyin bölümleri LC bakır ve diğer metallerin düzeylerini ölçmek ve lc dışındaki bölgelerde düzeyleri karşılaştırmak için kullanılabilir, hangi hastalık mekanizmasının anlaşılması için gereklidir. Bu protokolün diğer olası uygulamaları arasında dopamin beta-hidroksilaz, tirozin hidroksilaz ve lc'de tek tek ifade edilen diğer proteinlerin bolluğunun ve hücre içi dağılımının saptanması veya lc morfolojisi ve nöronal yoğunluk çalışmaları yer almaktadır.
