Bu protokol, genetik mutasyonların kas lifi fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, kas sağlığını iyileştirmeyi amaçlayan ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilir. Bu teknik, ileri eğitime gerek kalmadan nispeten kısa bir süre içinde çok sayıda kas lifindeki kontraktiliteyi izole etmek ve ölçmek için kullanılabilir.
Hidrojellerin bileşimi, hem sağlıklı hem de hastalıklı kaslardaki çevresel ipuçlarının etkisini kanıtlamak için değiştirilebilir. İşlemin en zorlu kısmı kasın ilk diseksiyonudur. Yeterli özen gösterilmezse, kasın hasar görmesi kas liflerinin canlılığında bir azalmaya neden olabilir.
Prosedürü gösterenler, araştırma teknisyeni Leander Vonk ve laboratuvarımda doktora adayı olan Osman Esen olacak. Ötanazi farenin alt arka bacağını ayak bileğinin hemen üstünde keserek başlayın. Ayağın dorsal tarafındaki deride ayak parmaklarına doğru bir kesi yapın.
Kaslara zarar vermemeye özen göstererek cildi ayak parmaklarına doğru dikkatlice soyun. Disseke edilmiş ayağı, 37 santigrat derecede 10 mililitre önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı içeren bir conta koruma kabına yerleştirin. Ayağı hala ayak parmaklarına bağlı olan deriden geçirin.
Alt bacağı ayak bileğinin ötesine sabitleyin ve kasın üstündeki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Tendonu topuktan kesin ve kası kaldırın. Ayak parmağı tendonları açığa çıkana kadar bağ dokusu boyunca kasın yanında ve altında kesin.
Üç tendonun uzunluğunun yarısı açığa çıktığında tendonları kesin. Kasları ayaktan serbest bırakın ve FDB kaslarının tendonlarını sabitleyin. Kalan bağ dokusunu kastan çıkarın.
Temiz kas dokusunu önceden ısıtılmış diseksiyon ortamı içeren bir tüpe aktarın. Brevis kasını kas sindirim ortamını içeren bir tüpe aktarmak için serolojik bir pipet kullanın. Dokuyu 80 dakika boyunca% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
Kas, üç mililitre diseksiyon ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hazırlanan tritürasyon uçlarını kullanarak, en büyüğünden en küçüğüne giden kası pipetleyin ve kas lifleri tendondan çıkana kadar tritürasyona devam edin. Tendonlar bir P200 ucu ile çıkarılabilir.
Ayrışmış kas liflerini, 10 mililitre diseksiyon ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir pelet oluşana kadar liflerin inkübatöre 20 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Tüm ortamı fiber peletin üstünden dikkatlice pipetin.
Buz üzerinde, hücreleri kas başına 875 mikrolitre hücre karışımında yeniden askıya alın. 125 mikrolitre hücre süspansiyonu aliquot içeren tüplere 125 mikrolitre matris hücre karışımı ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek nazik pipetleme ile karıştırın.
Son karışımı hemen bir kuyuya aktarın. Kas liflerinin canlılığını mikroskop altında kontrol edin. Katılaşmayı teşvik etmek için jelleri 30 ila 45 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
İşiniz bittiğinde, her bir kuyucuğa dikkatlice 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Optik tabanlı kontraktil ölçüm sistemini, floresan lambayı, elektrik hücresi pacer'ı ve bilgisayarı açın. İzole kas liflerini uyarmak için elektrik stimülatörü 10 voltta 1.0 hertz'e ayarlayın ve beş milisaniyelik bir nabız süresine sahip olun.
Plakayı ölçüm sistemine yerleştirin. Pacer'ı kesici uca bağlayın ve kültür plakasına yerleştirin. IonWizard programını açın.
Tamam'ı tıklatın. Dosya simgesine tıklayarak yeni bir dosya açın ve ardından Yeni'yi tıklayın. Programın doğru deney iskelet sarkomerinde olup olmadığını kontrol etmek için Deneyi Topla'yı seçin. Denemeyi değiştirmek için, istediğiniz denemeye tıklayın ve ardından Ekle'ye basın.
SARC 20X, ortalama çizgiler, tek FFT, 250 hertz örnekleme hızı ve 10 saniyelik bir alma süresi ayarlarını uygulayın. Ölçüm sistemi sıcaklığını 25 santigrat dereceye değiştirin. Yeni bir ekran açılır penceresi oluşturmak için açık hücre bulucuya tıklayın.
Plaka Tipini ve Aktif Kuyuları seçin. Netleme kaydırma çubuğunu ayarlayarak fiberleri odaklayın. Elektriksel stimülasyonu indüklemek ve lif seğirmesini gözlemlemek için tempoyu etkinleştirin.
Sarkomerleri odakta tutarak, ölçüm alanının fiber ucuna sabitlendiğinden emin olun, böylece sarkomerler dikey olarak çalışır. Sarkomerler odaklandığında, araç çubuğunda kasılma üzerine sağa doğru hareket edecek tek bir tepe görülebilir. Ölçüm sistemindeki lifleri ölçün.
Denemeyi başlatmak için Başlat'ı tıklayın. 10 kasılma geçicisini ölçmeye başlamak için Q tuşuna basın. Dörtten fazla geçici ses gürültüsüz görünüyorsa, Z tuşuna basarak ölçümü kabul edin.
Geçiciler çok fazla gürültü içeriyorsa, ölçümleri reddedin. Deneme tamamlandıktan sonra hücre bulucu penceresini kapatmak için Durdur'a basın. Dosyayı kaydedin ve yeni bir dosya oluşturun.
CytoSolver masaüstü programını açın, ardından İçe Aktar'a tıklayın ve analiz edilecek dosyaları seçin. Analiz tamamlandıktan sonra mavi, kırmızı ve gri tepeleri tanımlayın. Dışa Aktar'a tıklayın.
Geçici Verilere Ortalama başlıklı kutuları seçin ve Excel'e aktarın. Yanal hareketleri ve diğer etkileyen faktörleri önlediği için 3D fibrin hidrojelde kullanılabilir kasılma kas ölçümlerinin daha yüksek bir yüzdesi elde edildi. Fiber gömmenin maksimum büzülme hızı veya sarkomer kısalması üzerinde önemli bir etkisi yoktu.
Saf bazal matrikste azalmış kasılma, muhtemelen jel sertliği veya artmış hücre matriksi etkileşimi nedeniyle gözlenmiştir. Benzer şekilde, bazal matris gömme de fibrin hidrojeline kıyasla sarkomer kısalmasını azaltmıştır. İzole kas liflerinin oldukça kırılgan olduğunu ve pipetleme sırasında onlara zarar vermemek için ekstra özen gösterilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.
İzolasyon işleminden sonra immün boyama, protein ve RNA izolasyonu gibi yöntemler de uygulanabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, olgun kas lifi fonksiyonunu yüksek verimli bir şekilde incelemek için yeni olanaklar açmıştır.
