يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير الطفرات الجينية على وظيفة الألياف العضلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لدراسات فحص المخدرات التي تهدف إلى تحسين صحة العضلات. يمكن استخدام هذه التقنية لعزل وقياس الانقباض في عدد كبير من ألياف العضلات في فترة زمنية قصيرة نسبيا دون الحاجة إلى تدريب متقدم.
يمكن تغيير تكوين الهلاميات المائية من أجل إثبات تأثير الإشارات البيئية في كل من العضلات السليمة والمريضة. الجزء الأكثر تحديا في الإجراء هو التشريح الأولي للعضلة. إذا لم يتم توخي الحذر الكافي ، يمكن أن يؤدي تلف العضلات إلى انخفاض في صلاحية ألياف العضلات.
سيوضح الإجراء ليندر فونك ، فني أبحاث ، وعثمان إيسن ، مرشح الدكتوراه في مختبري. ابدأ بقطع الساق الخلفية السفلية للفأر الرحيم فوق الكاحل مباشرة. قم بعمل شق على الجلد على الجانب الظهري من القدم باتجاه أصابع القدم.
قشر الجلد بعناية نحو أصابع القدم مع الحرص على عدم إتلاف العضلات. ضع القدم المشرحة في طبق واقي للختم يحتوي على 10 ملليلتر من وسط التشريح المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. دبوس القدم من خلال الجلد لا يزال متصلا بأصابع القدم.
ثبت أسفل الساق خارج الكاحل واستأصل بعناية النسيج الضام أعلى العضلات. قطع الوتر عند الكعب ورفع العضلات. قطع جنبا إلى جنب مع وتحت العضلات من خلال النسيج الضام حتى تنكشف أوتار إصبع القدم.
قطع الأوتار عندما يتعرض نصف طول الأوتار الثلاثة. حرر العضلات من القدم وثبت أوتار عضلات FDB. قم بإزالة أي نسيج ضام متبقي من العضلات.
انقل الأنسجة العضلية النظيفة إلى أنبوب يحتوي على وسط تشريح تم تسخينه مسبقا. استخدم ماصة مصلية لنقل العضلة الحجية إلى أنبوب يحتوي على وسط هضم العضلات. ضع المنديل في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 80 دقيقة.
نقل العضلات إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط التشريح. باستخدام أطراف التثليج المعدة ، تنتقل ماصة العضلات من الأكبر إلى الأصغر وتستمر في التثليج حتى تخرج ألياف العضلات من الوتر. يمكن إزالة الأوتار بطرف P200.
انقل الألياف العضلية المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا يحتوي على 10 ملليلتر من وسط التشريح. اترك الألياف تستقر في الحاضنة لمدة 20 دقيقة حتى تتشكل حبيبة. ماصة بعناية كل وسيط من أعلى بيليه الألياف.
على الجليد ، أعد تعليق الخلايا في 875 ميكرولتر من مزيج الخلايا لكل عضلة. أضف 125 ميكرولترا من مزيج خلايا المصفوفة في أنابيب تحتوي على 125 ميكرولترا من قسمة تعليق الخلية. تخلط عن طريق ماصة لطيفة ، وتجنب تشكيل فقاعات.
انقل المزيج النهائي على الفور إلى بئر. تحقق من صلاحية ألياف العضلات تحت المجهر. ضع المواد الهلامية في حاضنة لمدة 30 إلى 45 دقيقة لتعزيز التصلب.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع في كل بئر. قم بتشغيل نظام القياس المقلص القائم على البصريات ، ومصباح الفلورسنت ، وجهاز قياس الخلايا الكهربائية ، والكمبيوتر. اضبط المحفز الكهربائي على 1.0 هرتز عند 10 فولت مع مدة نبضة تبلغ خمسة مللي ثانية لتحفيز ألياف العضلات المعزولة.
أدخل اللوحة في نظام القياس. قم بتوصيل pacer بالملحق وأدخله في لوحة الثقافة. افتح برنامج IonWizard.
انقر فوق موافق. افتح ملفا جديدا بالنقر فوق رمز ملف ، ثم انقر فوق جديد. حدد تجميع التجربة للتحقق مما إذا كان البرنامج يستخدم القطعة العضلية الهيكلية للتجربة الصحيحة. لتغيير التجربة ، انقر فوق التجربة المطلوبة ثم اضغط على إضافة.
قم بتطبيق الإعدادات SARC 20X ، ومتوسط الخطوط ، و FFT الفردي ، ومعدل أخذ العينات 250 هرتز ، ووقت الاستحواذ 10 ثوان. قم بتغيير درجة حرارة نظام القياس إلى 25 درجة مئوية. انقر فوق مكتشف الخلية المفتوح لإنشاء نافذة منبثقة جديدة للشاشة.
حدد نوع اللوحة والآبار النشطة. ركز الألياف عن طريق ضبط شريط تمرير التركيز. قم بتمكين السرعة للحث على التحفيز الكهربائي ومراقبة ارتعاش الألياف.
مع الحفاظ على القطع العضلية في بؤرة التركيز ، تأكد من تثبيت منطقة القياس على طرف الألياف بحيث تعمل القطع العضلية عموديا. عند تركيز القطع العضلية، تظهر قمة واحدة في شريط الأدوات تتحرك إلى اليمين عند الانقباض. قياس الألياف على نظام القياس.
النقرات ابدأ لبدء التجربة. اضغط على المفتاح Q لبدء قياس 10 انكماش عابر. إذا بدا أكثر من أربعة عابرين خاليين من الضوضاء ، فاقبل القياس بالضغط على المفتاح Z.
إذا كانت العابرات تحتوي على الكثير من الضوضاء ، فارفض القياسات. اضغط على إيقاف لإغلاق نافذة مكتشف الخلايا بمجرد انتهاء التجربة. احفظ الملف وأنشئ ملفا جديدا.
افتح برنامج CytoSolver لسطح المكتب ، ثم انقر فوق استيراد وحدد الملفات المراد تحليلها. بمجرد اكتمال التحليل ، حدد القمم الزرقاء والحمراء والرمادية. انقر فوق تصدير.
حدد المربعات التي تحمل عنوان المتوسط إلى البيانات العابرة وقم بالتصدير إلى Excel. تم الحصول على نسبة أعلى من قياسات العضلات المقلصة القابلة للاستخدام في هيدروجيل الفيبرين 3D لأنه منع الحركات الجانبية والعوامل المؤثرة الأخرى. لم يكن لتضمين الألياف تأثير كبير على سرعة الانكماش القصوى أو تقصير القطعة العضلية.
لوحظ انخفاض الانكماش في مصفوفة القاع النقي على الأرجح بسبب صلابة الهلام أو زيادة تفاعل مصفوفة الخلية. وبالمثل ، أدى تضمين مصفوفة الطابق السفلي أيضا إلى تقليل تقصير القطعة العضلية مقارنة بهيدروجيل الفيبرين. من المهم أن تتذكر أن ألياف العضلات المعزولة هشة للغاية ويجب توخي الحذر الشديد حتى لا تتلفها أثناء سحب الماصة.
بعد إجراء العزل ، يمكن أيضا إجراء طرق مثل التلوين المناعي وعزل البروتين والحمض النووي الريبي. وقد فتح تطوير هذه التقنية إمكانيات جديدة لدراسة وظيفة الألياف العضلية الناضجة بطريقة عالية الإنتاجية.
