Este protocolo se puede utilizar para evaluar el impacto de las mutaciones genéticas en la función de la fibra muscular. Además, se puede utilizar para estudios de detección de drogas destinados a mejorar la salud muscular. Esta técnica se puede utilizar para aislar y medir la contractilidad en un gran número de fibras musculares en un período de tiempo relativamente corto sin necesidad de entrenamiento avanzado.
La composición de los hidrogeles se puede cambiar para atestiguar el efecto de las señales ambientales tanto en el músculo sano como en el enfermo. La parte más desafiante del procedimiento es la disección inicial del músculo. Si no se tiene suficiente cuidado, el daño al músculo puede conducir a una disminución en la viabilidad de las fibras musculares.
Demostrando el procedimiento estarán Leander Vonk, un técnico de investigación, y Osman Esen, un candidato a doctorado en mi laboratorio. Comience cortando la pata trasera inferior del ratón sacrificado justo por encima del tobillo. Haga una incisión en la piel del lado dorsal del pie hacia los dedos de los pies.
Pelar cuidadosamente la piel hacia los dedos de los pies teniendo cuidado de no dañar el músculo. Coloque el pie diseccionado en un plato protector de sello que contenga 10 mililitros de medio de disección precalentado a 37 grados centígrados. Fije el pie a través de la piel aún unida a los dedos de los pies.
Fije la parte inferior de la pierna más allá del tobillo y extirpe cuidadosamente el tejido conectivo en la parte superior del músculo. Corte el tendón en el talón y levante el músculo. Corte junto y debajo del músculo a través del tejido conectivo hasta que los tendones del dedo del pie estén expuestos.
Corte los tendones cuando la mitad de la longitud de tres tendones esté expuesta. Suelte el músculo del pie y fije los tendones de los músculos FDB. Retire cualquier tejido conectivo restante del músculo.
Transfiera el tejido muscular limpio a un tubo que contenga medio de disección precalentado. Utilice una pipeta serológica para transferir el músculo brevis a un tubo que contenga el medio de digestión muscular. Coloque el tejido en una incubadora a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono durante 80 minutos.
Transfiera el músculo a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de medio de disección. Usando puntas de trituración preparadas, pipetea el músculo yendo del más grande al más pequeño y continúa la trituración hasta que las fibras musculares se hayan desprendido del tendón. Los tendones se pueden extirpar con una punta P200.
Transfiera las fibras musculares disociadas a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de disección. Deje que las fibras se asienten en la incubadora durante 20 minutos hasta que se forme un pellet. Pipetear cuidadosamente todo el medio desde la parte superior del pellet de fibra.
En el hielo, resuspender las células en 875 microlitros de mezcla celular por músculo. Añadir 125 microlitros de mezcla de células de matriz en tubos que contengan 125 microlitros de alícuota de suspensión celular. Mezclar mediante un suave pipeteo, evitando la formación de burbujas.
Transfiera la mezcla final inmediatamente a un pozo. Compruebe la viabilidad de las fibras musculares bajo el microscopio. Coloque los geles en una incubadora durante 30 a 45 minutos para promover la solidificación.
Una vez hecho esto, agregue cuidadosamente 500 microlitros de medio de cultivo en cada pocillo. Encienda el sistema de medición contráctil basado en óptica, la lámpara fluorescente, el marcapasos de celda eléctrica y la computadora. Ajuste el estimulador eléctrico a 1.0 hercios a 10 voltios con una duración de pulso de cinco milisegundos para estimular las fibras musculares aisladas.
Inserte la placa en el sistema de medición. Conecte el marcapasos al inserto e insértelo en la placa de cultivo. Abra el programa IonWizard.
Haga clic en Aceptar. Abra un nuevo archivo haciendo clic en el icono Archivo y, a continuación, haga clic en Nuevo. Seleccione Recopilar experimento para comprobar si el programa está en el sarcómero esquelético del experimento correcto. Para cambiar el experimento, haga clic en el experimento deseado y, a continuación, pulse Añadir.
Aplique la configuración SARC 20X, líneas promedio, FFT simple, frecuencia de muestreo de 250 hercios y un tiempo de adquisición de 10 segundos. Cambie la temperatura del sistema de medición a 25 grados centígrados. Haga clic en el buscador de celdas abierto para crear una nueva ventana emergente de pantalla.
Seleccione Tipo de placa y Pocillos activos. Enfoca las fibras ajustando la barra deslizante de enfoque. Permita que la estimulación induzca estimulación eléctrica y observe las contracciones de las fibras.
Manteniendo los sarcómeros enfocados, asegúrese de que el área de medición esté fijada en el extremo de la fibra de tal manera que los sarcómeros corran verticalmente. Cuando los sarcómeros están enfocados, un solo pico es visible en la barra de herramientas que se moverá hacia la derecha al contraerse. Mida las fibras en el sistema de medición.
Haga clic en Inicio para comenzar el experimento. Presione la tecla Q para comenzar a medir 10 transitorios de contracción. Si más de cuatro transitorios parecen libres de ruido, acepte la medición presionando la tecla Z.
Si los transitorios contienen demasiado ruido, rechace las mediciones. Presione Detener para cerrar la ventana del buscador de celdas una vez que concluya el experimento. Guarde el archivo y cree uno nuevo.
Abra el programa CytoSolver escritorio, luego haga clic en Importar y seleccione los archivos a analizar. Una vez completado el análisis, identifique los picos azules, rojos y grises. Haga clic en Exportar.
Seleccione las casillas tituladas Datos de promedio a transitorio y expórtelas a Excel. Se obtuvo un mayor porcentaje de mediciones de músculo contráctil utilizables en el hidrogel de fibrina 3D, ya que evitó los movimientos laterales y otros factores influyentes. La incrustación de fibra no tuvo un efecto significativo en la velocidad máxima de contracción o el acortamiento del sarcómero.
Se observó una contracción reducida en la matriz basal pura probablemente debido a la rigidez del gel o al aumento de la interacción de la matriz celular. Del mismo modo, la incrustación de la matriz basal también redujo el acortamiento del sarcómero en comparación con el hidrogel de fibrina. Es importante recordar que las fibras musculares aisladas son bastante frágiles y se debe tener especial cuidado de no dañarlas durante el pipeteo.
Después del procedimiento de aislamiento, también se pueden realizar métodos como inmunotinción, aislamiento de proteínas y ARN. El desarrollo de esta técnica ha abierto nuevas posibilidades para estudiar la función de la fibra muscular madura de una manera de alto rendimiento.
