이 프로토콜은 유전적 돌연변이가 근섬유 기능에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 근육 건강 개선을 목표로 하는 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 고급 훈련 없이 비교적 짧은 시간에 많은 수의 근육 섬유에서 수축성을 분리하고 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
하이드로겔의 구성은 건강한 근육과 병든 근육 모두에서 환경적 단서의 효과를 입증하기 위해 변경될 수 있습니다. 시술에서 가장 어려운 부분은 근육의 초기 절개입니다. 충분한주의를 기울이지 않으면 근육이 손상되어 근육 섬유의 생존력이 저하 될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 연구 기술자 인 Leander Vonk와 내 실험실의 박사 과정 후보자 인 Osman Esen이 될 것입니다. 안락사된 쥐의 뒷다리 아래쪽을 발목 바로 위에 자르는 것으로 시작합니다. 발가락을 향해 발의 등쪽 피부를 절개하십시오.
근육이 손상되지 않도록 조심하면서 발가락쪽으로 피부를 조심스럽게 벗겨냅니다. 해부된 발을 섭씨 37도에서 미리 예열된 해부 매체 10밀리리터가 들어 있는 씰 가드 접시에 넣습니다. 발가락에 붙어있는 피부를 통해 발을 고정하십시오.
발목 너머로 다리를 고정하고 근육 상단의 결합 조직을 조심스럽게 절제하십시오. 발 뒤꿈치의 힘줄을 자르고 근육을 들어 올리십시오. 발가락 힘줄이 노출될 때까지 결합 조직을 통해 근육의 옆과 아래를 자릅니다.
세 개의 힘줄 길이의 절반이 노출되면 힘줄을 자릅니다. 발에서 근육을 풀고 FDB 근육의 힘줄을 고정합니다. 근육에서 남아있는 결합 조직을 제거하십시오.
깨끗한 근육 조직을 미리 예열된 해부 매체가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 brevis 근육을 근육 소화 배지가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소 하에서 80분 동안 조직을 넣습니다.
3 밀리리터의 해부 매체가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 근육을 옮깁니다. 준비된 분쇄 팁을 사용하여 가장 큰 근육에서 가장 작은 근육으로 피펫팅하고 근육 섬유가 힘줄에서 빠질 때까지 분쇄를 계속합니다. 힘줄은 P200 팁으로 제거할 수 있습니다.
해리된 근육 섬유를 10밀리리터의 해부 매체가 들어 있는 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 펠릿이 형성 될 때까지 섬유가 인큐베이터에 20 분 동안 침전되도록하십시오. 섬유 펠릿 상단에서 모든 배지를 조심스럽게 피펫팅합니다.
얼음 위에서 근육 당 875 마이크로 리터의 세포 혼합물로 세포를 다시 일시 중단합니다. 125 마이크로리터의 매트릭스 세포 혼합물을 125 마이크로리터의 세포 현탁액 분취액을 포함하는 튜브에 추가합니다. 거품의 형성을 피하면서 부드럽게 피펫 팅으로 혼합하십시오.
최종 혼합물을 즉시 우물에 옮깁니다. 현미경으로 근육 섬유의 생존력을 확인하십시오. 응고를 촉진하기 위해 겔을 인큐베이터에 30-45 분 동안 두십시오.
완료되면 500마이크로리터의 배양 배지를 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 광학 기반 수축 측정 시스템, 형광등, 전기 셀 페이서 및 컴퓨터를 켭니다. 전기 자극기를 10볼트에서 1.0Hz로 설정하고 펄스 지속 시간을 5밀리초로 설정하여 분리된 근육 섬유를 자극합니다.
플레이트를 측정 시스템에 삽입합니다. 페이서를 인서트에 연결하고 배양 플레이트에 삽입합니다. IonWizard 프로그램을 엽니 다.
확인을 클릭합니다. 파일 아이콘을 클릭하여 새 파일을 연 다음 새로 만들기를 클릭합니다. 실험 수집을 선택하여 프로그램이 올바른 실험 골격 근위에 있는지 확인합니다. 실험을 변경하려면 원하는 실험을 클릭한 다음 추가를 누릅니다.
SARC 20X, 평균 라인, 단일 FFT, 250Hz 샘플링 속도 및 10초의 획득 시간 설정을 적용합니다. 측정 시스템 온도를 섭씨 25도로 변경합니다. 열린 셀 파인더를 클릭하여 새 화면 팝업을 만듭니다.
플레이트 유형(Plate Type) 및 활성 웰(Active Wells)을 선택합니다. 초점 슬라이더 막대를 조정하여 섬유의 초점을 맞춥니다. 페이싱을 활성화하여 전기 자극을 유도하고 섬유 경련을 관찰합니다.
sarcomeres에 초점을 유지하면서 sarcomeres가 수직으로 실행되도록 측정 영역이 섬유 끝에 고정되어 있는지 확인하십시오. sarcomeres에 초점이 맞춰지면 수축시 오른쪽으로 이동하는 단일 피크가 도구 모음에 표시됩니다. 측정 시스템에서 섬유를 측정합니다.
시작을 클릭하여 실험을 시작합니다. Q 키를 눌러 10개의 수축 과도 상태 측정을 시작합니다. 4개 이상의 과도 현상에 노이즈가 없는 것처럼 보이면 Z 키를 눌러 측정을 수락합니다.
과도 상태에 너무 많은 노이즈가 포함되어 있으면 측정을 거부합니다. 실험이 끝나면 Stop을 눌러 세포 찾기 창을 닫습니다. 파일을 저장하고 새 파일을 만듭니다.
CytoSolver 데스크탑 프로그램을 연 다음 가져 오기를 클릭하고 분석 할 파일을 선택하십시오. 분석이 완료되면 파란색, 빨간색 및 회색 피크를 식별합니다. 내보내기를 클릭합니다.
Average to Transient Data라는 제목의 상자를 선택하고 Excel로 내보냅니다. 3D 피브린 하이드로겔은 측면 움직임 및 기타 영향 요인을 방지하기 때문에 사용 가능한 수축 근육 측정의 더 높은 비율을 얻었습니다. 섬유 임베딩은 최대 수축 속도 또는 근종 단축에 큰 영향을 미치지 않았습니다.
순수한 기저 매트릭스에서 감소된 수축은 겔 강성 또는 증가된 세포 매트릭스 상호 작용으로 인한 것으로 관찰되었습니다. 유사하게, 지하 매트릭스 임베딩은 또한 피브린 하이드로겔에 비해 육종 단축을 감소시켰습니다. 분리된 근육 섬유는 매우 약하므로 피펫팅 중에 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
분리 절차 후, 면역염색, 단백질 및 RNA 분리와 같은 방법이 또한 수행될 수 있다. 이 기술의 개발은 성숙한 근육 섬유 기능을 높은 처리량 방식으로 연구할 수 있는 새로운 가능성을 열었습니다.
