Этот протокол может быть использован для оценки влияния генетических мутаций на функцию мышечных волокон. Кроме того, его можно использовать для скрининговых исследований лекарств, направленных на улучшение здоровья мышц. Этот метод может быть использован для выделения и измерения сократительной способности в большом количестве мышечных волокон за относительно короткий промежуток времени без необходимости повышения квалификации.
Состав гидрогелей может быть изменен, чтобы засвидетельствовать влияние сигналов окружающей среды как на здоровые, так и на больные мышцы. Самой сложной частью процедуры является начальное рассечение мышцы. Если не соблюдать достаточную осторожность, повреждение мышцы может привести к снижению жизнеспособности мышечных волокон.
Продемонстрацией процедуры будут Леандер Вонк, техник-исследователь, и Осман Эсен, кандидат наук в моей лаборатории. Начните с отрезания нижней задней ноги усыпленной мыши чуть выше лодыжки. Сделайте разрез на коже на тыльной стороне стопы по направлению к пальцам ног.
Осторожно очистите кожу по направлению к пальцам ног, стараясь не повредить мышцы. Поместите рассеченную ногу в посуду для защиты от тюленей, содержащую 10 миллилитров предварительно разогретой диссекционной среды при температуре 37 градусов Цельсия. Проткните стопу через кожу, все еще прикрепленную к пальцам ног.
Прижмите голень за лодыжку и аккуратно иссеките соединительную ткань поверх мышцы. Разрежьте сухожилие в пятке и поднимите мышцу. Разрезайте вдоль и под мышцей соединительную ткань до тех пор, пока не обнажятся сухожилия пальцев ног.
Разрежьте сухожилия, когда обнажается половина длины трех сухожилий. Освободите мышцу стопы и надавите на сухожилия мышц FDB. Удалите оставшуюся соединительную ткань из мышцы.
Перенесите чистую мышечную ткань в трубку, содержащую предварительно подогретую диссекционную среду. Используйте серологическую пипетку для переноса мышцы бревиса в трубку, содержащую мышечную среду для переваривания. Поместите ткань в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа на 80 минут.
Перенесите мышцу в 15-миллилитровую трубку, содержащую три миллилитра диссекционной среды. Используя подготовленные наконечники для растирания, проведите пипеткой мышцу, идущую от самой большой к самой маленькой, и продолжайте растирание до тех пор, пока мышечные волокна не оторвутся от сухожилия. Сухожилия можно удалить с помощью наконечника P200.
Перенесите диссоциированные мышечные волокна в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров диссекционной среды. Дайте волокнам осесть в инкубаторе в течение 20 минут, пока не образуется гранула. Аккуратно нанесите пипеткой всю среду с верхней части волокнистой гранулы.
На льду ресуспендируют клетки в 875 микролитрах клеточной смеси на мышцу. Добавьте 125 микролитров смеси матричных клеток в пробирки, содержащие 125 микролитров аликвоты клеточной суспензии. Смешайте легким пипетированием, избегая образования пузырьков.
Готовую смесь сразу же переложите в лунку. Проверьте жизнеспособность мышечных волокон под микроскопом. Поместите гели в инкубатор на 30-45 минут, чтобы они способствовали затвердеванию.
После этого осторожно добавьте по 500 микролитров питательной среды в каждую лунку. Включите систему измерения сократительной способности на основе оптики, люминесцентную лампу, электрокардиостимулятор и компьютер. Установите электростимулятор на 1,0 герц при напряжении 10 вольт с длительностью импульса пять миллисекунд для стимуляции изолированных мышечных волокон.
Вставьте пластину в измерительную систему. Подсоедините иноходец к вкладышу и вставьте его в культуральную пластину. Откройте программу IonWizard.
Нажмите кнопку ОК. Откройте новый файл, щелкнув значок «Файл», затем нажмите «Создать». Выберите «Собрать эксперимент», чтобы проверить, правильно ли программа настроена на скелетный саркомер эксперимента. Чтобы изменить эксперимент, нажмите на нужный эксперимент и нажмите кнопку Добавить.
Примените настройки SARC 20X, средние линии, одиночный БПФ, частоту дискретизации 250 Гц и время сбора данных 10 секунд. Измените температуру измерительной системы на 25 градусов по Цельсию. Нажмите на средство поиска открытых ячеек, чтобы создать новое всплывающее окно экрана.
Выберите тип пластины и активные скважины. Сфокусируйте волокна, отрегулировав ползунок фокусировки. Включите стимуляцию, чтобы вызвать электрическую стимуляцию, и наблюдайте за подергиванием волокон.
Удерживая саркомеры в фокусе, убедитесь, что область измерения зафиксирована на конце волокна таким образом, чтобы саркомеры проходили вертикально. Когда саркомеры сфокусированы, на панели инструментов виден один пик, который при сокращении смещается вправо. Измерьте волокна на измерительной системе.
Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать эксперимент. Нажмите клавишу Q, чтобы начать измерение 10 переходных процессов сокращения. Если более четырех переходных процессов выглядят бесшумными, примите измерение, нажав клавишу Z.
Если переходные процессы содержат слишком много шума, отклоните измерения. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы закрыть окно поиска ячеек после завершения эксперимента. Сохраните файл и создайте новый.
Откройте рабочий стол программы CytoSolver, затем нажмите «Импорт» и выберите файлы для анализа. После завершения анализа определите синий, красный и серый пики. Нажмите «Экспорт».
Установите флажки под названием «Средние и временные данные» и экспортируйте их в Excel. Более высокий процент пригодных для использования измерений сократительных мышц был получен в 3D-гидрогеле фибрина, поскольку он предотвращал боковые движения и другие влияющие факторы. Встраивание волокон не оказало существенного влияния на максимальную скорость сокращения или укорочение саркомера.
Наблюдалось снижение сокращения в чистом базисном матриксе, вероятно, из-за жесткости геля или повышенного взаимодействия с клеточным матриксом. Точно так же встраивание фундаментальной матрицы также уменьшало укорочение саркомера по сравнению с гидрогелем фибрина. Важно помнить, что изолированные мышечные волокна довольно хрупкие, и следует проявлять особую осторожность, чтобы не повредить их во время пипетки.
После процедуры выделения также могут быть выполнены такие методы, как иммуноокрашивание, выделение белка и РНК. Развитие этого метода открыло новые возможности для изучения функции зрелых мышечных волокон с высокой пропускной способностью.
