Bu araştırma kısmen Eurostars hibesi Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) ve NWO-VICI hibe 91818602 (JV) tarafından finanse edilmiştir.

1. Hücre kültürü ortamının ve reaktiflerinin hazırlanması
<ol><li>49 mL RPMI1640'ye 1 mL B27 takviyesi (50x) ekleyerek hiPSC-CM ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Önce 45 mL hiPSC-CM ortamına 5 mL knockout serum replasmanı ekleyerek yeniden kaplama ortamını hazırlayın. Daha sonra 22.5 μL Y-27632 ROCK inhibitörü (1:2.000 seyreltme; stok konsantrasyonu: 10 mM) ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Bodrum membran kaplı plakaları aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın:<ol><li>Bir şişe bazal membranı gece boyunca buzdolabında veya bir buz kutusunda çözdürün.</li>
		<li>Bazal membranı uygun miktarda Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium/Ham's F12 (DMEM/F12) ile seyreltin. Her bazal membran partisi farklı bir konsantrasyona sahip olduğundan, 1 mg/1 mL seyreltmeye ulaşmak için gereken DMEM/F12 miktarını hesaplayın. -20 °C'de saklamak için 0,5 veya 1 mL alikotlar yapın. NOT: Adım 1.3.2'nin bir akış başlığı içindeki buz üzerinde yapılması gerekir.</li>
		<li>0.5 mL bazal membran alikotunu çözün ve 6 mL DMEM / F12 ile seyreltin. İyice karıştırın.</li>
		<li>24 oyuklu bir plakaya 250 μL seyreltilmiş bazal membran/kuyu pipetleyerek plakayı kaplayın. Farklı plaka formatları için her bir oyuğun yüzey alanına göre hesaplayın, örneğin, 6 oyuklu bir plakada 1 mL/kuyu.</li>
		<li>Plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2 mM alikot hazırlamak için üreticinin kılavuzuna göre Fura-2'yi dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek Fura-1 alikotlarını hazırlayın. Alikotları -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. hiPSC-CM'lerin kültürlenmesi
<ol><li>Bir şişe hiPSC-CM'yi 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün. Şişenin çözülmüş içeriğini 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücrelere damla damla 10 mL yeniden kaplama ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 100 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve 1 mL yeniden kaplama ortamı ekleyin. Peleti yeniden süspanse etmek ve hücre kümelerini çıkarmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hücre sayısını saymak için bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanın.</li>
	<li>Bodrum membranını inkübe edilmiş plakadan çıkarın ve yeniden kaplama ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri, bazal membranla kaplanmış 6/12/24/48/96 oyuklu bir plaka üzerine uygun hücre yoğunluğuna sahip bir plaka (örneğin, 24 oyuklu bir plakada 250.000 hücre/kuyu) ile kaplayın. NOT: Ca2+ geçici deneyler için, hücreleri cam tabanlı plakalara yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün ortamı hiPSC-CM kültür ortamı ile değiştirin ve ardından ortamı 24 oyuklu bir plakada 0,5 mL / kuyu kullanarak her gün yenileyin.</li>
	<li>HiPSC-CM'ler çözülme ve yeniden kaplamadan sonra iyileştikten sonra (bu protokolde yeniden kaplamadan 3-5 gün sonra) kontraktilite ölçümlerini gerçekleştirin. NOT: Eşit olmayan hücre yeniden kaplaması durumunda, bir grup hücrenin yeniden kaplanan hücrelerin geri kalanıyla temas halinde olmaması ve düzensiz veya senkronize olmayan bir vuruş modeli göstermesi mümkündür. Asenkronizmi önlemek için, hücrelerin eşit dağılımına ve her kuyucukta senkronize edilmiş iyi bağlanmış bir hiPSC-CM tek katmanına sahip olunması tavsiye edilir.</li>
</ol>3. Kasılma ölçümleri
<ol><li>Optik tabanlı ölçüm sistemini, mikroskop ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağını ve bilgisayarı açın (bkz.</li>
	<li>Programı açın ve yeni bir dosya açın. Ekranın sol üst kısmındaki Dosya altında, Yeni'yi tıklatın.</li>
	<li>Topla'ya tıklayın, Deneyler'i seçin ve ardından "iPSC + Kalsiyum"u seçin.</li>
	<li>Klima kontrol cihazını açın. Sıcaklığı 37 °C'ye ve CO2 seviyesini %5'e ayarlayın.</li>
	<li>HiPSC-CM kültür ortamını Tyrode çözeltisi (24 oyuklu bir plakada 0,5 mL / kuyucuk) ile değiştirin. Plaka kapağını klima kontrol kapağıyla değiştirin. NOT: Kalsiyum geçici ölçümlerinin yapılması gerekiyorsa, hücrelere bölüm 2'te açıklandığı gibi Fura-4 yükleyin.</li>
	<li>Klima kontrol cihazı sıcaklığın 37 °C olduğunu gösterdiğinde plakayı optik tabanlı ölçüm sisteminin içine yerleştirin. NOT: Büzülme, parlak alan koşulları kullanılarak ölçülür.</li>
	<li>Araç çubuğunun altındaki Hücre bulucuyu aç'a tıklayın ve yeni bir ekranın açılmasını bekleyin. Ekranın sağ üst köşesinde, plaka formatını ve kuyuyu seçin.</li>
	<li>Bir kuyu seçin, senkronize kasılma ve gevşemeyi gözlemlemek için kuyu içinde bir alan seçin, Başlat'a basın, Ölçüm ekle'ye tıklayın. Ayarlarda ölçümlerin süresini seçin (alan başına 10 sn). Eşzamansız kasılma ölçümlerini hemen atın ve yeni bir alan seçin. NOT: Gerçek zamanlı kasılma geçici akımları monitörde görülebilir. Senkronize kasılmalar için düzgün bir sürekli geçici olay gözlenirken, asenkron kasılmalar için küçük ekstra pikler gözlenir.</li>
	<li>Kuyu boyutuna bağlı olarak kuyu içindeki birden fazla alanı ölçün. Örneğin, bu çalışmayı takip etmek için, 24 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 10 alanı ölçün. Yalnızca temel ölçümlerin gerekli olması ve herhangi bir bileşiği test etme planının olmaması durumunda, 3.13 adımından devam edin.</li>
	<li>Bir kuyu içindeki alanlar ölçüldükten sonra, stresör/bileşiği kuyuya eklemek için tam düğmesine basın ve optik tabanlı ölçüm cihazını açın (örneğin, 500 nM ISO, Tyrode içinde çözülmüş).</li>
	<li>İlgilenilen bileşiğin inkübasyon süresini seçin (bu protokolde ISO ile 2 dakika).</li>
	<li>Optik tabanlı ölçüm cihazının, temel ölçümlerin gerçekleştirildiği alanlarda ölçüm yapmasına izin vermek için otomatik ölçüme tıklayın, bu da kuyu içinde eşleştirilmiş ölçümlerle sonuçlanır.</li>
	<li>Kuyudaki tüm ölçümler yapıldıktan sonra tamamla'ya basın.</li>
	<li>Ekranın sağ üst köşesinden bir sonraki kuyuyu seçin.</li>
	<li>Gerekli tüm kuyular için ölçümlere devam edin.</li>
	<li>Gerekli tüm kuyular ölçüldükten sonra durdur'a tıklayın ve dosyayı kaydedin. NOT: Klima kontrolü, sabit CO2'yi korumak için kullanılır. Bu, bileşiklerin/stresörlerin hiPSC-CM'ler üzerindeki etkisinin yüksek hızlı bir şekilde ölçülmesine olanak tanır.</li>
</ol>4. Kalsiyum geçici ölçümleri
<ol><li>37 °C Tyrode çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Fura-2 alikotlarını Tiroz çözeltisi içinde çözün, böylece hücrelere 1 μM Fura-2'lik bir nihai konsantrasyon eklenecektir. NOT: Fura-2'yi kullanırken, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için akış başlığındaki ışıkların kapalı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve Fura-2 içeren Tyrode solüsyonu ile değiştirin.</li>
	<li>Bir inkübatörde veya optik tabanlı ölçüm sisteminde 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Fura-2 içeren Tyrode solüsyonunu çıkarın ve ardından 2x'i taze Tyrode solüsyonu ile yıkayın. Son olarak, Fura-2'nin esterden arındırılmasına izin vermek için hücreleri Tyrode çözeltisinde 37 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı optik tabanlı ölçüm sisteminin içine yerleştirin ve bölüm 3'te açıklandığı gibi ölçümleri başlatın. NOT: Adım 4.6'da. Ölçümler kasılma ölçümleri ile aynı anda başlatılarak, oransal bir kalsiyum geçişi kaydedilir: 100 μm'lik bir noktada 340 nm ve 385 nm'de uyarma; 510 ± 40 nm'de toplanan emisyon. Kontraktilite izlerine ek olarak, ekranda gerçek zamanlı oransal kalsiyum geçişleri görünecektir.</li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Verileri analiz etmek için masaüstünde CytoSolver'a tıklayın.</li>
	<li>İçe aktar'a tıklayın ve analiz edilecek dosya(lar)ı seçin.</li>
	<li>Program analizi gerçekleştirdikten sonra, ekranda görünen kabul edilen (mavi) ve reddedilen (kırmızı) geçişleri gözlemleyin (Şekil 1A). NOT: Burada, sinyal-gürültü oranı (SNR) ve uyum iyiliği (R 2) ile tanımlanan aşağıdaki varsayılan reddetme kriterleri kullanılmıştır: Kasılma geçici olayları için R 2 > 0.9 ve SNR > 4 ve kalsiyum geçişleri için R2 > 0.5 ve SNR > 3. Bu reddetme kriterleri, ölçümlerin kalitesine, hücrelerin kalitesine ve araştırmacı için birincil sonuca bağlı olarak kullanıcı tarafından ayarlanabilir. Örneğin, araştırmacının ilgisi esas olarak gevşeme kinetiği ise, kriterler zirveye kadar geçen süre değişkenleri için düşürülebilir. Çok güçlü kalsiyum geçişleri elde edilirse, daha gürültülü verileri hariç tutmak için SNR'nin artırılması gerekebilir.</li>
	<li>Dışa aktar'a tıklayın ve ortalama geçici veriler için işaretleyin. Bir elektronik tabloda sunulan analiz edilen verileri inceleyin.</li>
	<li>Bilgisayarı ve diğer tüm aletleri kapatın.</li>
</ol>

hiPSC-CM'lerde Kalsiyum ve Kontraktilite Parametrelerinin Gerçek Zamanlı Ölçümleri

<ol>
	<li>Tsao, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2022+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 145 (8), e153 (2022).</li><li>Ghionzoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+drug+targets+in+heart+failure+treatment.">Current and emerging drug targets in heart failure treatment.</a> Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).</li><li>Criscione, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-on-a-chip+platforms+and+biosensor+integration+for+disease+modeling+and+phenotypic+drug+screening.">Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening.</a> Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).</li><li>vander Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+and+animal-free+innovations+for+cardiovascular+research:+current+status+and+routes+to+be+explored.+Consensus+document+of+the+ESC+Working+Group+on+Myocardial+Function+and+the+ESC+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart.">Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart.</a> Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).</li><li>Maddah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+platform+for+functional+characterization+of+stem-cell-derived+cardiomyocytes+with+applications+in+cardiotoxicity+testing.">A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).</li><li>Sala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLEMOTION:+A+versatile+open+software+tool+to+quantify+cardiomyocyte+and+cardiac+muscle+contraction+in+vitro+and+in+vivo.">MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+fluorescent+tagging+of+endogenous+proteins+in+human+pluripotent+stem+cells.">CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy-linked+mutation+in+troponin+T+causes+myofibrillar+disarray+and+pro-arrhythmic+action+potential+changes+in+human+iPSC+cardiomyocytes.">Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP3R-mediated+compensatory+mechanism+for+calcium+handling+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+with+cardiac+ryanodine+receptor+deficiency.">IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).</li><li>Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SuperPlots:+communicating+reproducibility+and+variability+in+cell+biology.">SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology.</a> The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).</li><li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+maturation:+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine.">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li><li>Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+on-axis+platform+for+all-optical+electrophysiology+with+near-infrared+probes+in+human+stem-cell-derived+cardiomyocytes.">Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).</li><li>van Meer, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+excitation-contraction+coupling+parameters+identifies+mechanisms+underlying+contractile+responses+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).</li></ol>

EM, CytoCypher BV'nin bir çalışanıdır. MH, CytoCypher BV'nin CEO'sudur. Kalan yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

Bu çalışmada, hiPSC-CM'ler üzerinde kontraktilite ve kalsiyum geçici ölçümleri yapmak ve stresörlerin/ilaçların bu hücreler üzerindeki etkisini incelemek için bir yöntem tanımlanmıştır. Kontraktilite ölçümleri, oransal kalsiyum ölçümleri ve ISO'ya yanıt, biyolojik kopyalar olarak üç farklı farklılaşma turunda gerçekleştirildi. Her biyolojik kopya için, teknik kopyalar olarak üç kuyuda ölçümler yapıldı. Ölçümlerin bu şekilde yapılmasının nedeni, numunenin ve platformun biyolojik değişkenliğinin ve teknik değişkenliğinin değerlendirilebilmesini sağlamaktı. Uygun sayıda biyolojik ve teknik kopyayı göz önünde bulundurmanın yanı sıra, hiPSC-CM kültür koşulu, sürekli ve sağlam sonuçlar elde etmek için önemli bir rol oynayabilir. Ölçümler sırasında hiPSC-CM'lerin yaşı, ortamın bileşimi, yeniden kaplama koşulları ve bileşik inkübasyon süresi gibi kriterlerle tutarlı olmak önemlidir. Bu çalışmada, bir kuyuda 10 sn boyunca 11 alanı iki kez ölçmek ortalama 568 ± 24 sn sürmüştür. Bu, 79 ± 11 s'lik bir ISO inkübasyon süresini içerir. Bu, kuyu başına kabaca 10 dakikaya iner ve bu da araştırmacıların ~ 4 saatte tam bir 24 kuyulu plakayı ölçmelerini sağlamalıdır. İklim kontrolü, sabit CO2'yi korumak için kullanılır. Bu, bileşiklerin/stresörlerin hiPSC-CM'ler üzerindeki etkisinin yüksek hızlı bir şekilde ölçülmesine olanak tanır.
iPSC-CM'lerin kasılma fonksiyonunu ölçmek için, optogenetik13 veya etiketsiz video tabanlı mikroskopi 5,6'ya dayanan birkaç mevcut sistem vardır. Optogenetik sistemler oldukça karmaşıktır ve elektrofiziksel ve/veya kontraktilite verilerini elde etmek için özel teknikler gerektirir. Diğer sistemler, çok fazla depolama alanı gerektiren ve video alımı sırasında doğrudan geri bildirimden yoksun olan videoların post-hoc analizine dayanır. Ek olarak, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğün elde edilmesi zordur ve bu da yetersiz örneklemeye neden olabilir. Benzer şekilde, floresan raportörler7 ile CRISPR/CAS-9 ile düzenlenmiş hiPSC-CM'ler, kardiyomiyosit davranışı üzerinde istenmeyen etkilere neden olabilir. Büzülme-gevşeme ölçümleri için floresan boyaların kullanılması da zarif bir yaklaşımdır, ancak aynı numune üzerinde daha uzun bir süre boyunca deney yapılmasını sınırlar14.
Bununla birlikte, bu optik tabanlı ölçüm platformu, herhangi bir floresan boya veya invaziv yöntem kullanmadan kasılma-gevşeme sürelerini ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, piksel korelasyonu uzamsal bilgi sağlamadığından, bu yöntem kasılmanın gücünü ölçmek için kullanılamaz, bunun yerine yalnızca kasılma ve gevşeme hızındaki değişiklikleri güvenilir bir şekilde tespit edebilir. Tanıtılan ölçüm sistemi sıcaklık kontrollüdür ve saniyede >200 kare çözünürlükte gerçek zamanlı olarak kalsiyum ve kasılma verilerini alabilir. Ek olarak, her ölçümün konumu saklanır, bu da eşleştirilmiş ölçümleri mümkün kılar ve böylece deneylerin gücünü artırır. Ayrıca bu platform, araştırmacılara deneyden hemen sonra veri depolama ve analiz etme olanağı sağlar. Genel olarak, bu optik tabanlı ölçüm sistemi, hücresel patomekanizmaları incelemek için umut verici bir yöntem olduğunu, bileşiklerin hiPSC-CM'lerin işlevselliği üzerindeki etkisini değerlendirebildiğini ve ilaç taramasında klinik öncesi süreçte yardımcı olabileceğini göstermektedir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65326">Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes</a>. The Authors section was updated from:
Rafeeh Dinani1,2 
Emmy Manders1,2,3 
Michiel Helmes1,2,3 
Lili Wang4 
Bjorn Knollmann4 
Diederik W. D. Kuster1,2 
Jolanda van der Velden1,2 
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University 
2Heart Failure &#38; Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences 
3CytoCypher BV 
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine
to:
Rafeeh Dinani1,2 
Emmy Manders1,2,3 
Michiel Helmes1,2,3 
Lili Wang4 
Bjorn C. Knollmann4 
Diederik W. D. Kuster1,2 
Jolanda van der Velden1,2 
1Division of Physiology, Amsterdam UMC, Vrije University 
2Heart Failure &#38; Arrhythmias, Amsterdam Cardiovascular Sciences 
3CytoCypher BV 
4Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65326">Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Kalp yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. 2019'da kardiyovasküler hastalık dünya çapında 18,6 milyon ölüme neden oldu ve bu da son on yılda %17,1'lik bir artışı yansıtıyor1. Araştırmacıların kalp yetmezliğini önlemek ve tedavi etmek için ilaç hedeflerini belirleme çabalarına rağmen, hasta sonuçları hala kötüdür2. Hayvan modellerinin patofizyolojisindeki insanlara göre farklılık, kalp yetmezliği tedavisinin optimizasyonu için sınırlı başarının altında yatan faktörlerden biri olabilir3. Hastalığı modellemek ve yeni ilaç bileşiklerinin toksisitesini ve etkinliğini test etmek için ek insan benzeri modeller garanti edilir.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), stresörler, iskemi, değişmiş metabolizma veya patojenik gen varyantları tarafından indüklenen hücresel patomekanizmaları ve ilaç müdahalelerinin etkinliğini ve toksisitesini tanımlamak için güçlü bir araçtır4. HiPSC-CM'lerin fonksiyonel özellikleri üzerindeki etkileri tanımlamak için, hücresel kasılmaların sistolik ve diyastolik özelliklerini tarafsız ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçen yüksek hızlı bir sistem garanti edilir. Bu çalışmanın genel amacı, optik tabanlı bir sistemin, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel parametrelerinin gerçek zamanlı analizlerini gerçekleştirmek için güçlü bir araç olduğunu göstermektir.
Şu anda, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini değerlendirmek için birden fazla platform vardır. Bununla birlikte, mevcut sistemler ya yavaş bir okuma sunar ya da gerekli sayıda hücre zor olabilir. Etiketsiz video ölçüm sistemleri5,6, çok fazla depolama alanı gerektiren ve video alımı sırasında doğrudan geri bildirimden yoksun olan videoların post-hoc analizine dayanır. Ek olarak, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğün elde edilmesi zordur ve yetersiz örneklemeye neden olabilir. Floresan raportörlerle kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 ile düzenlenmiş hiPSC-CM'ler7 gibi kardiyomiyosit özelliklerini belirlemeye yönelik diğer yöntemler, hücrelerin gen stabilitesine müdahale edebilir ve özel laboratuvar uzmanlığı gerektirebilir.
Yukarıda belirtilen sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu çalışmada benzersiz bir optik tabanlı ölçüm sistemi geliştirilmiş ve tanıtılmıştır. Bu platform, modifiye edilmemiş hiPSC-CM'leri plaka boyutunda herhangi bir sınırlama olmaksızın, gerekli herhangi bir plaka formatında yeniden kaplayarak kontraktilite ölçümlerini mümkün kılar. Ayrıca, gerçek zamanlı ölçümler, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel parametrelerinin doğrudan gözlemlenmesine ve analizine olanak tanır ve böylece protokolleri anında ayarlamak ve optimize etmek için deneysel bir ayar sağlar. Ayrıca, her ölçümün konumu saklanır, bu da aynı numune üzerinde eşleştirilmiş ölçümleri mümkün kılar ve böylece deneylerin gücünü artırır.
Optik tabanlı sistemi göstermek için, bir kontrol hiPSC-CM hattında kontraktilite ölçümleri yapıldı. Bu kontrol hiPSC hattı, normal karyotip8'e sahip sağlıklı bir erkek donörün dermal fibroblastından üretildi. Büzülme kinetiği, 250 Hz örnekleme frekansında gevşeme sırasında alınan bir referans çerçevesine göre piksel korelasyon değişikliklerine dayalı olarak 37 °C'de ölçüldü. Kasılmanın kesin başlangıcı her zaman kesin olarak belirlenemediğinden, tepe yüksekliğinin %20'sine ulaşılan zaman noktası (%20'si) zirveye kadar geçen sürenin ölçümleri için başlangıç noktası olarak alınmıştır. Bunu yaparak, bir örneklem içinde bu parametre için daha az değişkenlik bulundu. Benzer şekilde, sinyalin taban çizgisine döndüğü kesin anı değerlendirmek zor olduğundan, zirveden taban çizgisine dönüşün %80'ine ulaşmak için geçen süre (taban çizgisine %80'e kadar geçen süre) gevşeme süresini tanımlamak için kullanılmıştır.
Genel kasılma ölçümleri, istirahat atım frekanslarını,% 20 pikten pik kasılmaya kadar geçen süreyi (TP. Con) ve pik kasılmadan taban çizgisinin% 80'ine kadar geçen süre (TB. Con80) (Şekil 1B). Bir stres etkeninin etkisini test etmek için, hücreler izoprenaline (ISO) ile inkübe edildi. Ek olarak, kasılma ölçümleri ile tesadüfen, hücrelere 250 Hz'lik bir örnekleme frekansında Fura-2-asetoksimetil ester (Fura-2) yüklenerek Ca2+ geçici akımları ölçüldü. Ca 2+ ölçüm verileri, Ca2+ geçici (TP.Ca) içinde %20 tepeden tepeye kadar geçen süre ve taban çizgisinin (TB.Ca 80) tepeden %80'ine kadar geçen süre olarak gösterilir (Şekil 1C). Her alan için ortalama kasılma ve kalsiyum kinetik parametreleri elde etmek için hızlı, otomatik bir veri analiz aracı kullanıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 24 Well Black ID 14 mm</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>82421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSolver transient analysis tool</td>
			<td>CytoCypher</td>
			<td></td>
			<td>A fast automatic data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2, AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>15627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#8482; Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3542C</td>
			<td>Basement membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software</td>
			<td>CytoCypher</td>
			<td></td>
			<td>Optics-based measurement system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time measurements of calcium and contractility parameters in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), kardiyomiyosit fonksiyonundaki mutasyon aracılı değişiklikleri incelemek ve stresörlerin ve ilaç müdahalelerinin etkilerini tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu çalışmada, bu optik tabanlı sistemin, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel parametrelerini 2D olarak değerlendirmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir. Bu platformu kullanarak, farklı plaka düzenlerinde iyi korunmuş bir sıcaklık ortamında eşleştirilmiş ölçümler yapmak mümkündür. Üstelik bu sistem, araştırmacılara anlık veri analizi imkanı sağlıyor.
Bu makale, modifiye edilmemiş hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ölçmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Büzülme kinetiği, 250 Hz örnekleme frekansında gevşeme sırasında alınan bir referans çerçevesine göre piksel korelasyon değişikliklerine dayalı olarak 37 °C'de ölçülür. Ek olarak, hücreye Fura-2 gibi kalsiyuma duyarlı bir florofor yüklenerek hücre içi kalsiyum geçişlerinin eşzamanlı ölçümleri elde edilebilir. Bir hiperswitch kullanılarak, kasılma ölçümlerinin alanına karşılık gelen 50 μm çapında bir aydınlatma noktasında oransal kalsiyum ölçümleri gerçekleştirilebilir.

Heart failure is the leading cause of death worldwide. In 2019, cardiovascular disease caused 18.6 million deaths globally, which reflects a 17.1% increase over the past decade1. Despite the efforts of researchers to identify drug targets to prevent and cure heart failure, patient outcomes are still poor2. The difference in the pathophysiology of animal models with respect to humans could be one of the underlying factors in the limited success for the optimization of heart failure therapy3. Additional human-like models are warranted to model disease and test the toxicity and effectiveness of novel drug compounds.
Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool to define cellular pathomechanisms induced by stressors, ischemia, altered metabolism, or pathogenic gene variants, and the effectiveness and toxicity of drug interventions4. To define effects on the functional properties of hiPSC-CMs, a high-speed system that measures the systolic and diastolic properties of cellular contractions in an unbiased and reproducible manner is warranted. This overall goal of the current study is to demonstrate that an optics-based system is a powerful tool to perform real-time analyses of the functional parameters of hiPSC-CMs.
Currently, there are multiple platforms to evaluate the contractility of hiPSC-CMs. However, current systems either offer a slow readout, or the required number of cells might be a challenge. Label-free video measurement systems5,6 rely on post-hoc analysis of videos, which requires a lot of storage and lacks direct feedback during video acquisition. In addition, sufficient temporal and spatial resolution is hard to achieve, and may result in undersampling. Other methods to determine cardiomyocyte properties, such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-edited hiPSC-CMs7 with fluorescent reporters might interfere with the gene stability of the cells and require specialized laboratory expertise.
To overcome the limitations mentioned above, a unique optics-based measurement system was developed and introduced in this study. This platform enables contractility measurements on unmodified hiPSC-CMs by simply replating them on any required plate format, without any limitation in plate size. Moreover, real-time measurements allow direct observation and analyses of the functional parameters of hiPSC-CMs, and thereby provide an experimental setting to instantly adjust and optimize protocols. Moreover, the location of each measurement is stored, which enables paired measurements on the same sample, thereby increasing the power of the experiments.
To demonstrate the optics-based system, contractility measurements were performed on a control hiPSC-CM line. This control hiPSC line was generated from the dermal fibroblast of a healthy male donor with a normal karyotype8. Contraction kinetics were measured at 37 &#176;C, based on pixel correlation changes relative to a reference frame taken during relaxation at a 250 Hz sampling frequency. As the exact start of contraction cannot always be unambiguously determined, the time point at which 20% of the peak height was reached (time to peak 20%) was taken as the starting point for measurements of time to peak. By doing so, less variability was found for this parameter within one sample. Similarly, as the exact moment at which the signal returns to baseline is difficult to assess, the time it took to reach 80% of the return to baseline from peak (time to baseline 80% ) was used to describe the relaxation time.
Overall contractility measurements included resting beating frequencies, the time from 20% peak to peak contraction (TP.Con), and the time from peak contraction to 80% of baseline (TB.Con80) (Figure 1B). To test the effect of a stressor, cells were incubated with isoprenaline (ISO). In addition, coincidentally with contractility measurements, Ca2+ transients were measured by loading the cells with Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2 AM) at a sampling frequency of 250 Hz. Ratiometric Ca2+ measurements9 using a hyperswitch were done on a 50 &#181;m diameter illumination area, corresponding to the area of the contractility measurements. Ca2+ measurement data are depicted as time from 20% peak to peak in the Ca2+ transient (TP.Ca) and the time from peak to 80% of the baseline (TB.Ca80) (Figure 1C). A fast, automatic data analysis tool was used to yield average contractile and calcium kinetic parameters for each area.

Yazar Spotlight: İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kalsiyum ve Kontraktilite Parametrelerinin Gerçek Zamanlı Ölçümleri  

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte function and defining the effects of stressors and drug interventions. There's a need for a platform in which contractility and calcium handling of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes can be measured in a user-friendly and reproducible manner. This method enables researchers to study contractility of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes by pixel correlation and measuring intracellular calcium transients simultaneously by loading the cells with calcium-sensitive fluorophore.By using this platform, it's possible to perform paired measurements in a well-preserved temperature environment and different plate formats, and to access the data instantly. This method enables the study of cellular pathomechanisms and evaluates the effect of compounds and the functionality of human iPSC-derived cardiomyocytes, that can be helpful in the preclinical drug screening process.

Bu protokolü takiben, kontraktilite, Ca2+ geçici akımları ve hiPSC-CM'lerde bir bileşiğe yanıt ölçümleri yapıldı. Bu optik tabanlı ölçüm sistemi kullanılarak, hiPSC-CM'ler gerekli plakalar üzerine kolayca yeniden kaplanabilir ve kontraktilite ölçümleri gerçekleştirilebilir. Kasılma, 100 μm x 100 μm'lik bir ilgi bölgesinde (ROI) saniyede 250 karede, bir referans kareye göre piksel korelasyonu hesaplanarak ölçülür. Referans çerçevesi, diyastol sonunda sistem tarafından otomatik olarak algılanır. Kasılma ölçümleri ile eş zamanlı olarak, bir oransal kalsiyum geçişi kaydedilir.
Bu çalışmada, üç biyolojik kopya olarak üç farklı farklılaşma turu kullanılmıştır. Her bir farklılaşma partisi için, üç kuyu teknik kopya olarak ölçüldü. Bu çalışma 24 kuyulu plakalar kullanılarak gerçekleştirilmiş ve her kuyu içindeki 10 alan ölçülmüştür. Ölçümlerden sonra, verileri hemen analiz etmek için CytoSolver programı kullanıldı. Aşağıdaki parametreler rapor edildi: dinlenme atma frekansı, TP. Con ve TB. Kontrol hiPSC-CM'lerinCon 80'i (Şekil 2A-C). Bahsedilen her parametre için verilerin değişkenliğini görselleştirmek için, her bir kuyu içindeki ölçümler ve her bir farklılaşma turu için üç kuyunun ortalama değerleri üst parseller10 olarak sunulur. Her bir farklılaşma turu için ve üç tur arasındaki verilerin değişkenliğini daha iyi değerlendirmek için, her parametre için varyans katsayısı (Şekil 2D) hesaplanmıştır. Şekil 2D'de gösterildiği gibi, bir biyolojik kopyaya karşılık gelen teknik kopyaların değerleri, bu yöntemin sağlamlığını gösteren birbirine çok yakın bir aralıkta (yani düşük varyans katsayısı) yer almaktadır.
Bu uygulama, ilaç etkilerini test etmek için çok uygundur. Burada, seçici olmayan bir β-adrenerjik reseptör agonisti olan 500 nM ISO'nun kontrol hiPSC-CM'lerinin kontraktilitesi üzerindeki etkisi test edildi. Bu bileşiğin kalp atış hızını arttırdığı ve pozitif bir lusitropik etki gösterdiği bilinmektedir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ISO tüm kuyucuklarda atma frekansını önemli ölçüde artırdı. ISO ayrıca, TP'deki bir düşüşte belirgin olan kinetiği de artırdı. Con ve TB. Con80 (Şekil 3B,C). Genel olarak, ISO ile inkübasyon üzerine, tüm kuyucuklarda dayak frekansı önemli ölçüde artmış, kasılma ve gevşeme süresinde bir azalma olmuştur, bu da bu bileşiğe beklenen yanıtın bu platform tarafından kaydedildiğini göstermiştir.
Kontraktilite ölçümlerine paralel olarak kalsiyum ölçümleri de yapıldı. Kasılma verileriyle aynı şekilde (Şekil 2), hiPSC-CM'lerin kalsiyum ölçüm verileri Şekil 4'te gösterilmektedir. TB.Ca80 , izole sıçan veya fare kardiyomiyositlerinden önemli ölçüde daha yavaştır, bu da kısmen türler ve kalp atış hızı farklılıkları11 ile ve ayrıca sarkoplazmik retikulum içindeki daha düşük kalsiyum dinamikleri ve birincil hücrelere kıyasla kalsiyum işleme proteinlerinin daha düşük ekspresyonu nedeniyle hiPSC-CM'lerde olgunlaşmamış kalsiyum kullanımıile açıklanmaktadır 12. Kasılma verilerine benzer şekilde, kalsiyum ölçümleri için varyans katsayısı hesaplanmıştır ve teknik ve biyolojik kopyalar içinde düşük değişkenlik göstermektedir (Şekil 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig01.jpg"> Şekil 1: Verileri analiz etmek için deneyden sonra CytoSolver geçici analiz aracının hemen kullanımı. (A) Bir kuyu içinde ölçülen bir alanın kabul edilen geçici akımlarına (tümü mavi renkte) bir örnek. Panel A1, kasılma geçişlerini göstermektedir. Panel A2, kalsiyum geçişlerini temsil eder. (B) Bir tur diferansiyasyonun üç kuyusundaki ölçümlerden elde edilen ortalama kasılma geçicisi. Her bir tek veya ortalama geçici olaydan, farklı zaman noktalarından zirveye kadar olan veriler (TP. Con) ve taban çizgisine kadar geçen süre (TB. Con) geçici kasılma çıkarılabilir. Daralmanın kesin başlangıcı her zaman kesin olarak belirlenemediğinden, zirveye ulaşma süresinin ölçümleri için başlangıç noktası olarak %20'lik zirveye kadar geçen süre alınır. Benzer şekilde, sinyalin taban çizgisine döndüğü tam anı değerlendirmek zordur. Bu nedenle, gevşeme süresini tanımlamak için %80'e kadar geçen süre kullanılır. İşte, TP. Con (zirveye kadar geçen süre - zirveye ulaşma süresi% 20) ve TB. Con80 (taban çizgisine kadar geçen süre %80 - zirveye kadar geçen süre) kullanılır. (C) Bir tur farklılaşmanın üç kuyusundaki ölçümlerden elde edilen ortalama kalsiyum geçici verileri. Her bir tek veya ortalama kalsiyum geçişinden, kalsiyum geçişlerinin zirvesine (TP.Ca) ve başlangıç noktasına (TB.Ca) kadar geçen farklı zaman noktalarından veriler çıkarılabilir. Zirveye kadar geçen süre ölçümleri için başlangıç noktası %20'ye kadar olan süre ve taban çizgisine kadar geçen süre için bitiş noktası %80'e kadar olan zamandır. Bu çalışmada TP.Ca (zirveye kadar geçen süre - zirveye kadar geçen süre %20) ve TB.Ca 80 (başlangıç süresi %80 - zirveye kadar geçen süre) kullanılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig02.jpg"> Şekil 2: Üç farklı farklılaşma turunda gerçekleştirilen temel kasılma ölçümleri. Her farklılaşma turu için üç biyolojik kopya ve üç kuyu (yani, üç teknik kopya). Her bir farklılaşma turu için üç ana sembol, her bir kuyucuk içindeki ölçülen alanların (soluk renklerdeki arka plan sembolleri) ortalama değerini temsil eder. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Dinlenme atma frekansı ile ilgili veriler Hertz cinsinden ve TP için temsil edilir. Con ve TB. Con80, veriler saniye cinsindendir. (A) Dinlenme vuruş frekansı. (B) Zirveye kadar geçen süre (TP. Con). (C) Başlangıç süresi% 80 (TB. Con80). (D) Her bir turda ve her üç farklılaşma turunda elde edilen veriler arasındaki değişimi değerlendirmek için, her bir kuyucuğun ortalama değerleri kullanılarak varyans katsayısı yüzdesi hesaplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig03.jpg"> Şekil 3: Başlangıçta (-) ve üç diferansiyasyon turundan üç kuyucukta ISO (+) ile inkübasyondan sonra kontraktilite ölçümleri. (A) Dinlenme vuruş frekansı (-) ve 500 nM ISO (+) ile inkübasyondan sonra atma frekansı. (B) Zirveye kadar geçen süre (TP. Con) başlangıçta ve ISO ile inkübasyondan sonra ölçümler. (C) Başlangıç süresi% 80 (TB. Con80) başlangıçta ve ISO ile inkübasyondan sonra ölçümler. ISO'nun kontraktilite parametreleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için, Bonferroni düzeltmeli iki yönlü bir Anova gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Dinlenme vuruş frekansı ile ilgili veriler Hertz cinsinden ve TP için temsil edilir. Con ve TB. Con80, veriler saniye cinsinden temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65326/65326fig04.jpg"> Şekil 4: Üç tur farklılaşmadan üç kuyucuk üzerinde gerçekleştirilen temel kalsiyum geçici ölçümleri. (A) Kalsiyum geçişlerinin %80'inin (TB.Ca80) zirveye ulaşma süresi (TP.Ca) ve (B) başlangıç süresi. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. TP.Ca veTB.Ca 80 veri saniye cinsinden temsil edilir. (C) Her bir turda ve her üç farklılaşma turunda elde edilen veriler arasındaki değişimi değerlendirmek için, her bir kuyucuğun ortalama değeri kullanılarak varyans katsayısı yüzdesi hesaplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65326/65326fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte ...

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler, kardiyomiyosit fonksiyonundaki mutasyon aracılı değişiklikleri incelemek ve stresörlerin ve ilaç müdahalelerinin etkilerini tanımlamak için güçlü bir araçtır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilitesinin ve kalsiyum kullanımının kullanıcı dostu ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülebildiği bir platforma ihtiyaç vardır. Bu yöntem, araştırmacıların insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilitesini piksel korelasyonu ile incelemelerini ve hücreleri kalsiyuma duyarlı florofor ile yükleyerek hücre içi kalsiyum geçişlerini aynı anda ölçmelerini sağlar.Bu platformu kullanarak, iyi korunmuş bir sıcaklık ortamında ve farklı plaka formatlarında eşleştirilmiş ölçümler yapmak ve verilere anında erişmek mümkündür. Bu yöntem, hücresel patomekanizmaların incelenmesini sağlar ve klinik öncesi ilaç tarama sürecinde yardımcı olabilecek bileşiklerin etkisini ve insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin işlevselliğini değerlendirir.

real-time-measurements-calcium-contractility-parameters-human-induced

Research

JoVE Journal

Biology

Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

1.7K Görüntüleme.  Vrije University. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler, kardiyomiyosit fonksiyonundaki mutasyon aracılı değişiklikleri incelemek ve stresörlerin ve ilaç müdahalelerinin etkilerini tanımlamak için güçlü bir araçtır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilitesinin ve kalsiyum kullanımının kullanıcı dostu ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülebildiği bir platforma ihtiyaç vardır. Bu yöntem, araştırmacıların ins...

Video: Yazar Spotlight: İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kalsiyum ve Kontraktilite Parametrelerinin Gerçek Zamanlı Ölçümleri  

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte function and defining the effects of stressors and drug interventions. In this study, it is demonstrated that this optics-based system is a powerful tool to assess the functional parameters of hiPSC-CMs in 2D. By using this platform, it is possible to perform paired measurements in a well-preserved temperature environment on different plate layouts. Moreover, this system provides researchers with instant data analysis.
This paper describes a method for measuring the contractility of unmodified hiPSC-CMs. Contraction kinetics are measured at 37 &#176;C based on pixel correlation changes relative to a reference frame taken at relaxation at a 250 Hz sampling frequency. Additionally, simultaneous measurements of intracellular calcium transients can be acquired by loading the cell with a calcium-sensitive fluorophore, such as Fura-2. Using a hyperswitch, ratiometric calcium measurements can be performed on a 50 &#181;m diameter illumination spot, corresponding to the area of the contractility measurements.

Here, an established method is described to perform contractility and calcium measurements in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using an optics-based platform. This platform enables researchers to study the effect of mutations and the response to various stimuli in a rapid and reproducible manner.

Biyoloji

Contractility Measurements in hiPSC-CMs

To begin, switch on the optics based measurement system, microscope light emitting diode source, and the computer. Start the program on the computer and open a new file by clicking new under the file in the top left of the screen. Click on collect, choose experiments and then select IPSC and calcium measurements.Next, replace the human IPSC cardiomyocyte culture medium with 0.5 milliliters per well of Tyrode's solution. In a 24 well plate. Replace the plate lid with the climate control lid and place the plate inside the optics based measurement system in the device adjusted to 37 degrees Celsius temperature.Click on open cell finder under the toolbar and wait for a new screen to appear. Select the plate format under chamber type and well at the top of the screen. Select a well and choose an area within the well to observe synchronized contraction and relaxation.Press start on the bottom left of the screen. Then click add measurement to measure the area. Measure approximately 10 areas per well in a 24 well plate.For only baseline measurements, continue the measurement from the next well. For testing the compounds, press complete once the areas within a well are measured. Open the optics based measurement instrument and add the desired stressor or compound to the well.After incubating at the desired time period, click on automatic measurement to perform paired measurements in the same areas of the well where the baseline measurements were performed. Press complete after all the measurements are performed. Choose the next well from the top right of the screen and continue measurements for all the required wells.After measuring all the required wells, click stop and save the file to the desired location.

hiPSC-CM'lerde Kontraktilite Ölçümleri

Calcium Transient Measurements in hiPSC-CMs

Dissolve the Fura-2 AM aliquots in Tyrode's Solution to get a final concentration of 1 micromolar Fura-2 AM to add to the cells. Aspirate the medium and replace it with Tyrode's Solution containing Fura-2 AM.Incubate for 15 minutes at 37 degrees Celsius in an incubator or the optics based measurement system. Remove the Tyrode's Solution containing Fura-2 AM and wash the wells two times with fresh Tyrode's Solution.Finally, incubate the cells in Tyrode's Solution for another five minutes at 37 degrees Celsius to allow deesterification of Fura-2 AM.Place the plate inside the optics based measurement system to proceed with the contractility measurements. Select a well, choose an area within the well to observe synchronized contraction and relaxation, and then click Start, and add measurement. In addition to the contractility traces, real-time ratiometric calcium transient appears on the screen.

hiPSC-CM'lerde Kalsiyum Geçici Ölçümleri

Contractility and Calcium Transient Measurements Data Analysis

To analyze the data, click CytoSolver on the desktop. Click on import from the file menu and select the files to be analyzed. After the analysis, observe the accepted and rejected transients on the screen.Click export on the top left of the screen and enable average transient data. Export to Excel file and then click export. Inspect the analyzed data presented in a spreadsheet.Turn off the computer and all the other instruments. Contractility measurements were analyzed with the CytoSolver program and the parameters of resting, beating frequency, time to peak contractility and time to baseline contractility of the control human IPSC cardiomyocytes were reported. The application of 500 nano molar ISO, a non-selective beta adrenergic receptor agonist, significantly increased the beating frequency in all wells.ISO also increased the kinetics evidenced by a decrease in time to peak contractility and time to baseline contractility. Like contractility, the calcium measurements were also analyzed, and the parameters were reported.