We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF &amp; VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.

Hayvan denekleri Prosedürleri Verilen veya Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Bred Konut ve Bakım için Uygulama Kodu yayınlanan UK Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ve hayvanlar Home Office ile uyumlu tutuldu uygun olarak yapılmıştır. Not: vahşi tip C57BL / 6J fareler kullanılarak yapılan deneyler iyi kurulmuş ve aşağıda tarif edilmiştir. Büyüme ve mineralizasyon hızları, burada ayrıntılı olarak açıklanan farklı olsa da, farklı fare türüne embriyonik metatars Benzer in vitro kültürlenebilir. 1. Diseksiyon Koşulları ve Araçların hazırlanması <ol><li> medya ve embriyonik esaslar kısırlık sağlamak için laminer akış kaputu tüm medya hazırlanması, dokuların diseksiyonu ve kültür çalışmaları yapmak. </li><li> Kültür ve diseksiyon ortam kullanımdan önce 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde en az 1 saat boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> diseksiyon sterilizemakas, Dumont # 5 ve Dumont # otoklav ile süper ince Vannas mikro bir makasla birlikte 4 cımbız (8 cm düz, 3 mm bıçaklar). Otoklavlamadan sonra,% 70 etanol içinde kullanmadan önce diseksiyon ekipman bırakın. </li></ol> Diseksiyon ve Kültür Medya 2. Hazırlık <ol><li> Diseksiyon ortamı hazırlayın <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (1:13) içinde α-Minimum Esansiyel Ortam (nükleosit olmayan, αMEM) seyreltilir ve filtre, bir 0.22 um, 33 mm çapında bir şırınga yoluyla sterilize edilmesinden önce 2 mg / m l&#39;de sığır serum albümini (BSA) tekrar süspansiyon filtre. Not: Diseksiyon ortamı yapılabilir filtre sterilize edilir ve belirsiz -20 ° C &#39;de parçalar halinde saklandı. </li></ol></li><li> Kültür ortamı hazırlayın <ol><li> (Her biri iyi bir 24-yuvalı kültür plakası) kültür ortamında 300 ul kültür, embriyonik metatarsalların. / BSA hac% 0,2 ekleyerek kültür ortamı hazırlayın; / Ml L-ASCO 5 ugrbic asit fosfat; 1 mM β-gliserofosfat (βGP; opsiyonel - Sonuçlar bölümüne bakınız); 0.05 mg / ml gentamisin ve αMEM 1.25 ug Amfoterisin B ve filtre, bir 0.22 um, 33 mm çapında bir şırınga filtre ile sterilize edilir. </li></ol></li></ol> 3. Fare Embriyonik metatarsal Diseksiyon ve Kültür <ol><li> İngiltere&#39;de ev ofis kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon ile, 15 günlük yaşındaki embriyoların barındıran, hamile fare itlaf </li><li> hayvan sırtüstü yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürtülerek cildin dezenfekte edin. Kullanarak diseksiyon makas deri ve karın boşluğuna maruz periton hem delici, orta hatta büyük bir kesi yapmak. </li><li> vücut boşluğunda dorsal bölgedeki hayvan iki rahim boynuzları bulun. öncelikle diseksiyon makas ile dikkatli kesiler ile mesometrium her uterin kurtararak ve sonra nihayet kendi üssünde serbest rahim boynuzları keserek rahim boynuzları çıkarın. Placdiseksiyon ortama e rahim boynuzları. </li><li> uterin horn boyunca implantasyon siteler arasında keserek her bir embriyo ayırın ve forseps kullanılarak bireysel Keselerden embriyolar kaldırmak. İngiltere&#39;de ev ofis talimatlarına uygun olarak kafaları kesilmek suretiyle itlaf embriyolar </li><li> % 70 etanol ile püskürterek cildin dezenfeksiyonu sonra, proksimal femur etrafında incising embriyolardan arka bacaklarda kaldırmak için Vannas mikro makas kullanın. kaldırılır sürede bu arka bacak kadar sağlar. metatarsal diseksiyon öncesinde diseksiyon orta batık bir petri içine arka bacaklarda yerleştirin. </li><li> bir mikroskop altında, kısma ve sabit arka ekstremite tutan içinde 4. cımbız kullanarak iken 5. cımbız kullanarak çekerek, embriyonik ayak çevreleyen deri kaldırmak başlar. Bu en etkili tibianın seviyesinde cildi açgözlü ve bilek doğru çekerek gerçekleştirilir. Bu aşamada makas kullanımı kesmek içinÇok ince deri gerekli değildir. </li><li> Dikkatle 4. cımbız ile embriyonik ayak tarsals tutun ve 5. cımbız kullanarak ve atın tarsals yakın kapalı kısma birinci ve beşinci metatarsallann çıkarın. </li><li> aynı pozisyonda tutulan ayak, kalan üç falanks ve metatars arasında bağ dokusunu bozmaya 5. cımbız kullanın. metatarsallara gelen falanksı kaldırmak için falanksların ve metatars arasındaki eklem 5. cımbız ucu yerleştirin. </li><li> Son olarak, tarsals ve metatars arasında bağ dokusunu bozmaya 5 cımbız # kullanın. Yine tarsals gelen tarsals ve metatars ve yavaşça serbest metatars arasında ortak alanda içerisinde 5. cımbız ucu yerleştirin. </li><li> Yavaşça taze diseksiyon orta içerisinde 4. cımbız ve yer ile artık özgür metatarsallann pick up. NOT: Dikkatli diseksiyon her embriyodan 6 metatarsallann sağlamalıdır. </li><li> Gerekli tüm metatars disseke edildiğinde, dikkatli bir şekildayrı ayrı kültür ortamı 300 ul ihtiva eden önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakalara lly yer metatarsalların. 14 güne kadar bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de kültür metatarsalların. NOT: Bu onların mineralizasyon yeteneği 26 etkilediği kültürün en azından 5 gün kadar E15 kültürlerin ortamı değiştirmek etmeyin. Bunun nedeni tam olarak bilinmemektedir, ancak doğrusal büyüme ve matris mineralizasyon metatars salınan büyüme faktörleri tarafından uyarılması bağlı olabilir. </li></ol> 4. Analiz ve metatarsal Kültürlerin Manipülasyon <ol><li> Diseksiyon (gün 0) gününde bir dijital kamera takılı ve görüntü analiz yazılımı ile bir mikroskop kullanılarak başlangıç ​​boyuna ölçümler yapmak. o kültürün birkaç gün sonra göründüğünde merkezi mineralizasyon zonunun uzunluğunu ölçün. </li><li> Gerekli periyodik olarak, bu noktada m kültürünün son güne kadar (genellikle her 2. gün) daha fazla ölçümler yapmaketatarsal kemikler (tartışıldığı) Gerekli sonuçları bağımlı işlenir. </li><li> Çeşitli dışsal faktörlerle metatarsal organı kültürlerin Supplement orta büyüme faktörleri, hormonlar ve kültür 22,24 gün 0&#39;dan farmakolojik ajanlar, örneğin. Bu tür tüm çalışmalarda, muamele edilmemiş metatarsallar gerekmektedir kontrol eder. NOT: Kontrol kemikleri kontralateral bacak eşdeğer rudiment olduğu tavsiye olmasına rağmen, lineer büyüme veya kültür E15 2 nd cevherleşme potansiyeli herhangi bir farklılık olmamıştır, 3. ve 4. metatarslarda (aşağıya bakınız, Şekil 2) . </li></ol>

<ol>
	<li>Farquharson, C., Staines, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+no+bones+about+it.">The skeleton: no bones about it.</a> J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).</li><li>Berendsen, A. D., Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development.">Bone development.</a> Bone. 80, 14-18 (2015).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423, 332-336 (2003).</li><li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bone+development+and+extracellular+matrix+protein+genes+by+RUNX2.">Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.</a> Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).</li><li>de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+in+the+pathways+of+cartilage+and+bone+formation.">Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).</li><li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , (2005).</li><li>Farquharson, C., Jefferies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+and+longitudinal+bone+growth:+The+development+of+tibial+dyschondroplasia.">Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia.</a> Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495, 375-378 (2013).</li><li>Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+vesicles:+structure,+composition,+formation+and+function+in+calcification.">Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification.</a> Front. Biosci. 16, 2812 (2011).</li><li>Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+involvement+of+PHOSPHO1+in+matrix+vesicle-mediated+skeletal.">Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal.</a> J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).</li><li>Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+matrix+vesicles+in+skeletal+and+soft+tissue+mineralisation.">Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation.</a> Bone. 87, 147-158 (2016).</li><li>Brighton, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Growth+Plate.">Structure and Function of Growth Plate.</a> Clin. Orthop. , 22-32 (1978).</li><li>Shim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+growth+and+epiphyseal+fusion.">Pubertal growth and epiphyseal fusion.</a> Annals of pediatric endocrinology &amp; metabolism. 20, 8-12 (2015).</li><li>Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+to+bone+transitions+in+health+and+disease.">Cartilage to bone transitions in health and disease.</a> J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).</li><li>Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Chondrocyte+Performance+in+Growth-Plate+Cartilage+During+Longitudinal+Bone-Growth.">Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth.</a> Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).</li><li>Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Relationship+Between+The+Volume+Of+Hypertrophic+Chondrocytes+And+The+Rate+Of+Longitudinal+Bone-Growth+In+Growth+Plates.">Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates.</a> J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).</li><li>Thesingh, C. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mesenchyme+in+embryonic+long+bones+as+early+deposition+site+for+osteoclast+progenitor+cells.">The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells.</a> Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).</li><li>Scheven, B. A., Hamilton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+bone+growth+in+vitro:+effects+of+insulin-like+growth+factor+I+and+growth+hormone.">Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone.</a> Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).</li><li>Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+IGF+regulation+of+longitudinal+bone+growth+in+rat+metatarsal+rudiments+cultured+in+serum-free+medium.">Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium.</a> Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).</li><li>Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+cartilage+and+bone+development.">Methods to study cartilage and bone development.</a> Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).</li><li>Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+augments+chondrocyte+hypertrophy+and+reverses+glucocorticoid-mediated+growth+retardation+in+fetal+mice+metatarsal+cultures.">Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures.</a> Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).</li><li>Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+plate+sparing+effects+of+the+selective+glucocorticoid+receptor+modulator,+AL-438.">The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).</li><li>MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+restricted+potential+for+recovery+of+growth+plate+chondrogenesis+and+longitudinal+bone+growth+following+exposure+to+pro-inflammatory+cytokines.">The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines.</a> J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).</li><li>Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch-up+growth+after+dexamethasone+withdrawal+occurs+in+cultured+postnatal+rat+metatarsal+bones.">Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones.</a> J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).</li><li>Haaijman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+terminal+chondrocyte+differentiation+by+bone+morphogenetic+protein+7+(OP-1)+in+vitro+depends+on+the+periarticular+region+but+is+independent+of+parathyroid+hormone-related+peptide.">Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide.</a> Bone. 25, 397-404 (1999).</li><li>Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OP-1+(BMP-7)+affects+mRNA+expression+of+type+1,+II,+X+collagen,+and+matrix+Gla+protein+in+ossifying+long+bones+in+vitro.">OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro.</a> J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEPE+is+a+novel+regulator+of+growth+plate+cartilage+mineralization.">MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization.</a> Bone. 51, 418-430 (2012).</li><li>Kaufman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Boskey, A. L., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture+Systems+for+Studies+of+Bone+and+Tooth+Mineralization.">Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization.</a> Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined.</a> Bone Miner. 12, 141-155 (1991).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+calcification+of+growth+plate+cartilage+as+a+result+of+compressive+force+in+vitro.">Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro.</a> Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).</li><li>Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+osteoclastic+bone-resorption+by+mechanical+stimulation+in+vitro.">Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro.</a> Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).</li><li>Dobie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+linear+bone+growth+by+GH+in+the+absence+of+SOCS2+is+independent+of+IGF-1.">Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1.</a> J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).</li><li>Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+1+receptor+(IGF1R)+signaling+regulates+osterix+expression+and+cartilage+matrix+mineralization+during+endochondral+ossification.">Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification.</a> Bone. 83, 48-57 (2016).</li><li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+co-operativity+of+tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+(TNAP)+and+PHOSPHO1+during+initiation+of+skeletal+mineralization.">The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+Growth+Defect+and+Deployment+of+Transient+Chondrocyte+Behaviors+Underlie+Osteoarthritis+Onset+in+a+Natural+Murine+Model.">Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 68, 880-891 (2016).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fetal+mouse+metatarsal+bone+explant+as+a+model+of+angiogenesis.">The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis.</a> Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).</li><li>Libby, P., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C,+collagen,+and+cracks+in+the+plaque.">Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque.</a> Circulation. 105, 1396-1398 (2002).</li><li>Alvarez, J., Serra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+redundant+roles+of+Smad3+in+TGF-beta-mediated+regulation+of+long+bone+development+in+organ+culture.">Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture.</a> Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).</li><li>Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOCS2+is+the+critical+regulator+of+GH+action+in+murine+growth+plate+chondrogenesis.">SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

fare embriyonik metatarsallara kültürü endokondral büyüme ve mineralizasyon son derece fizyolojik bir model sağlar. İlk çalışmalar E15 fare metatars iskelet büyüme ve farklılaşma normal desen geçmesi onaylamıştır. Kıkırdak (kondrositler) ve kemik (osteoblastlar ve osteoklastlar) hücreleri ve bunların ilgili kollajen matris, in vivo olarak gözlenen ayırt edilemez. Ancak, bu modelin bazı tanınmış sınırlamalar vardır. osteoklast farklılaşması hızı (ancak farklılaşma kıkırdak değil) kemik büyümesi olarak bozulur. Kemik büyümesi in vivo gözlenen göre yaklaşık% 50 daha yavaş ve lokal faktörler (örneğin, IGF-1, BMP, vb) 31 üretimini etkileyen sistemik faktörler eksiklikler nedeniyle olabilir. Ayrıca, iyi bir kemik mekanik çevreye duyarlı olduğu bilinmektedir ve bu da C yanıt kültürlenmiş metatarsalların, için de geçerlidirmekanik yüklenme 32,33 olarak Hanges. Bu nedenle, yüksüz durumlarda, bu protokolde, mineralizasyon açıklanan ve mineral emilmesi bozulabilir. Bununla birlikte, metatarsal modeli doğrudan in vitro kültür sistemlerinde 2D ve 3D aracılığı ile mümkün değildir doğrusal kemik büyümesini ölçmek olanağı sunar. Biz ilk kez, gerçekten E15 fare metatars ve diseksiyonu ve kültür katılan protokol kapsamlı bir açıklama sağladı, deneyler için 2., 3. ve 4. metatarsallann havuzu geçerliliğini doğrulamaktadır. E17 / E18 metatarsallann yaygın (kültür içinde 14 günden fazla le) uzun süreler için ex vivo olarak büyümesi olağanüstü potansiyeli sayesinde kemik büyüme mekanizmalarını incelemek için kullanılır. Onlar embriyonik uzunlamasına kemik büyümesi üzerine büyüme faktörlerinin rollerini araştırmak için köklü bir modeldir.Ayrıca, doğum sonrası metatars diseksiyonu ve kültür sık olarak doğum sonrası kemik büyümesi ve fetal kemik büyümesi farklı 21 düzenlenmiş olduğu anlaşılmaktadır olarak doğum sonrası kemik büyümesi çevreleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılır. Kültürlü doğum sonrası metatarsallara gözlenen kemik büyümesi uzun vadeli çalışmalarda potansiyellerini sınırlayıcı ve bu doğum sonrası aşamada kemik büyümesi üzerine daha sistemik bir etkiye vurgulayarak, ancak embriyonik rudiments 25,34 gözlenen önemli ölçüde daha azdır. Gerçekten de, fareler 3 günlük sonrası metatarsalların tipik haliyle ölçülebilir bir artış 34 elde etmek için kullanılabilecek en son aşamasıdır. Burada E15 embriyonik metatarsal kemikler izolasyonu için bizim protokol açıklar. E15 metatarsal kemiklerde hydroxyapaptite mineral olmaması da rakipsiz uzunlamasına kemik büyümesini çevreleyen sadece mekanizmalarını araştırmak için bir model, ama inisiyasyon sağlamak anlamına geliriskelet mineralizasyonu. Terminal hipertrofik kondrosit bölgenin mineralize matriks daha sonra mineralize edilen kemik spesifik matris (osteoid) bırakmaya osteoblast işgal için bir iskele sağlar ve böyle bu ilk mineralizasyon başarılı ve fonksiyonel kemik oluşumu 35 için hayati önem taşımaktadır. Nitekim E15 metatarsallann kullanan son raporlar bir dizi mineralizasyon süreci 28,36,37 araştırılması için kendi benzersiz yeteneği doğruladı. Ayrıca, araştırmacılar, kemik büyümesi / mineralizasyon ayarı dışında model olarak embriyonik metatarsallara potansiyelini vurgulayarak, anjiyogenez 38 bir model olarak E15 metatarsallara kullanımını tarif etmişlerdir. Bizim tarif protokol laminer akış kaputu, diseksiyon gerçekleştirmek için bir mikroskop ve eksize rudiments kültürü için CO 2 inkübatör dahil olmak üzere yalnızca standart laboratuar ekipmanı gerektirir. Ayrıca, bir çok temel culOrta αMEM, BSA, antibiyotikler, antimikotikler ve L-askorbik asit ihtiva eden Ture (hidroksiprolin ve hidroksilizin sentezinde bir ko-faktörü, kollajen 39 üretimi için iki temel amino asitler), hayvan serası olarak tanımlanmamış katkı maddelerinin kullanımını önler . Geleneksel olarak, araştırmacılar, kültür embriyonik metatarsalların için kullanılan ortamlara βGP eklemiş ancak sonuçlar ortaya koyduğu gibi, ek bir fosfat kaynağı kullanımı, bu kültür sistemi başarılı mineralizasyonu için gerekli değildir. Bu ECM mineralizasyon destekleyen mekanizmaların anlaşılması bizim peşinde önemli bir bulgudur. Metatars önce uzun kemik gelişimi 40 düzenlenmesine büyüme faktörü beta dönüştürme rolünü araştırmak için Smad2 dominant-negatif formları içeren adenovirüs ile enfekte olmuştur. Burada da t gösteren gfp virüs partikülleri ile, vahşi tip E15 metatarsal kemiklerin başarılı bir transfeksiyon ortayaşapka lentiviral teknikleri kolayca metatarsal kültürlerde gen ekspresyonu işlemek için kabul edilebilir. Benzer şekilde, metatarsal organ kültürü sistemi daha iyi kemik büyüme sürecinde belirli bir genin rolünü anlamak için genetik olarak değiştirilmiş farelerin kemik gelişimini karşılaştırmak için mükemmel bir modeldir. Daha önceki çalışmalar endokondral kemik büyüme sitokin baskılayıcı sinyalizasyon-2 (SOCS2) rolünü belirlemek için metatarsal organ kültürü sistemi kullanmışlardır. SOCS2 içinde eksik fareler metatarsal kemiklerin kullanılması, söz konusu büyüme hormonu insülin benzeri büyüme faktörü kendi boyuna büyüme bağımsız taklit edebilen göstermiştir (IGF-1), büyüme hormonu tedavisi 34 yanıt yok, vahşi tip metatarsal kemikleri farklı olarak, 41. Bu metatarsal kültürleri, farklı genler ve / veya endokondral kemik büyümesi üzerine dışsal faktörlerin etkilerini incelemek için manipüle edilebilir ölçüde vurgulamaktadır. Özetle, detai sahipmanipüle edilebilir embriyonik metatarsal kemiklerin başarılı çıkarma ve kültür için bir yöntem açtı ve çeşitli analizler kullanılarak incelendi. Bu eks vivo modeli, bu nedenle tek tabaka ya da 3 boyutlu kültür hücrelerine göre daha fizyolojik bir model sağlayan, hem de kondrojenez farklı aşamalarında kondrositlerin içerdiği, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini tutar. Metatarsal organ kültürleri nedenle endokondral kemikleşme sorumlu moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir modeldir ve kemik fizyolojisi ve patofizyolojisi hem anlayışımızı ilerletmek için gerekli olan

iskelet iyon homeostaza, lokomosyon uzanan bir dizi fonksiyon vardır, son derece karmaşık, dinamik ve karmaşık bir organdır. Kemik ve kıkırdak oluşan bu iskeletinin yapısal, biyokimyasal ve mekanik bütünlük 1 muhafaza etmek üzere yapmaktadır fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarının oluşur. İskeletin temel işlevlerinden biri gelişme ve büyüme rolü vardır. Bu süreçler sıkı endokrin ve genetik kontrolü ile düzenlenir çoklu hücresel popülasyonların orkestrasyon gerektirir. Düz kemikler gibi kürek kemiği, kafatası ve sternum hariç, memeli iskelet endokondral kemikleşme olarak bilinen süreçte oluşur. Düzenlenmiştir, her iki moleküler ve mekansal bu işlem, mezoderm 2 öncelikle türetilen mezenkimal hücrelerin yoğunlaştırılması ile başlar. transkripsiyon faktörü SOX9 etkisi altında, hücreler thsıkıştırmaların e iç ifade ve tip II kollajen ve Agrekanın olarak kıkırdak spesifik hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri salgılayan, kondrosit içine ayırt. Yoğuşma marjı en Hücreler muhtemel kemik 3 çizen I kolajen ve Perikondriumun oluşturan türünü ifade eder. Daha sonra, perikondriyumda ve osteoprogenitor transkripsiyon faktörleri, Runx2 ve Osterix 4 ifadesi yönettiği, osteoblastlar içine ayırt. Bu osteoblast baskın yol açar ve bu katman kemiğin orta bölümünde çevresinde bir mineralize kemik yaka oluşturan periost yeniden adlandırıldı. Kıkırdaklı iskele periost ve işgali damar penetrasyon, onunla getiren haematopoetically kondrosit kalıntıları ve kıkırdak matrisin 5 çok rezorbe kemik rezorbe hücreleri, osteoklastlar, türetilmiş oluşur. oluşan boşluklar birincil kemikleşme sebebiyet veren osteoprogenitor tarafından doldurulurgiderek diyafizinde çekirdeğini kaplayan ve periost ile birleşir merkezi. Diğer hücreler kemik iliğinde neden olmaktadır. Doğumdan etrafında, kan damarları ve osteoprogenitor ikincil kemikleşme merkezini oluşturmak üzere gelişmekte olan diafizin her iki tarafında (epifiz) de kıkırdak zengin matris nüfuz. Epifiz büyüme plağı - - bütün uzun kemiklerin 6 doğrusal büyüme koordinasyonundan sorumludur uzun kemiklerin iki ucundaki epifiz ve diyafizine arasında yer alan kıkırdak bir grup. Büyüme plağı içindeki kondrositler başlangıçta çoğalırlar ve daha sonra transkripsiyon ve büyüme faktörlerinin sıralı ifadesi tarafından koordine morfolojik farklı bölgeleri, yoluyla ilerleme. bu olaylar dizisi doruk noktası, bu kıkırdak öncüsünün merkezinde kondrosit hücre döngüsü ve hipertrofisi çıkış olduğunu. Hipertrofik kondrositler güçlü tip X kolajen ve matris metalloproteinaz ifade-13 (MMP13) ve boyuna büyüme yönünde onların hatırı sayılır hacim genişleme memelilerde 7,8 kemik büyümesine en büyük katkıyı sağlar. Ayrıca, hipertrofik kondrositler matriks veziküllerinin serbest yoluyla çevreleyen ECM&#39;yi mineralize membran sınırlı yapılar fosfatazlar dahil (doku spesifik olmayan alkalin fosfataz (TNAP) ve PHOSPHO1) ve kalsiyum kanal proteinlerin (anneksinler yoluyla amorf kalsiyum fosfat üretimi için uzman ) 9-11. Bu kalsifiye kıkırdak osteoklast işe ve matris rezorpsiyonu ile sonuçlanan altta yatan kemik iliğinden kan damarlarının tarafından işgal edildi. Bu hızla mineralize olan osteoid tabakası yatıp kalsifiye kıkırdak kalıntıları yüzeyine osteoblast göç ve uyum izlemektedir. Primer spongioz dokuma kemik daha sonra ikincil sünger 12 lameller kemiğe tamir edilir. epifiz füzyon sonuçlarıendokondral kemikleşme 13 durması. Rahatsız geliştirme ve / veya boyuna kemik büyümesini 14 önleyecek şekilde endokondral ossifikasyon çok endokrin ve parakrin hormonlar ve büyüme faktörleri tarafından sıkı yönetmelik altındadır. Bu süreçleri destekleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların daha iyi anlaşılması, insan yararına yönelik klinik ilerlemeler bizim peşinde zorunludur. Benzerlik ve farklı yaş, konum ve türlerin büyüme plakaları arasındaki farklılıkları içine Önceki araştırmalar büyük ölçüde büyüme plağı dinamiklerini 15,16 çevreleyen fizyolojik mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlamıştır. Çevrelerinden kondrositlerin ayrılması, Col2a1 17 gibi önemli belirteçler ifade kaybı eşliğinde, farklılaşmadan neden olabilir Ancak, izole edilmiş kondrositlerin çalışma zordur. Fare metatarsal organı eksplant kültürü, piHollanda&#39;da Prof. Elisabeth Burger ve meslektaşları tarafından oneered, kültür in vivo 18 görülene taklit kemiklerin büyüme oranı olarak endokondral ossifikasyon ve kemik büyümesi çalışmak için son derece fizyolojik ex vivo modeldir. Benzersiz metatarsal organ kültürü farklı kültürleri 19-21 hücrelerin daha vivo duruma yakın koşullarının sağlanması, kondrogenezisi farklı aşamalarında kondrosit incelenmesine olanak tanır ve hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleri tutar. Ayrıca, bu model, birincil kondrosit kültürlerde mümkün değildir lineer kemik büyüme doğrudan incelenmesi için izin verir. Aynı zamanda, bu nedenle büyüme plağının yerel etkileri spesifik analiz izin sistemik ve lokal faktörlerin ayrılması için izin verir. metatarsalların kültürü birçok parametre incelenmesi için izin verir. toplam uzunluğunun ve mineralli bölgelerinin günlük ölçümleresaslar, standart faz kontrast mikroskobu ve görüntü analiz yazılımı ile gerçekleştirilebilir. In situ hibridizasyon ve immünohistolojik boyama histolojik, hali hazırda hücresel ve moleküler varlıklar, geleneksel hücre kültürü metotlarına göre önemli bir avantaj uzaysal çözünürlüğü sağlar metatarsal bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Immünohistokimyasal yaklaşım kıkırdak 22 çoğalan algılama ve 5-bromo-2&#39;-deoksiüridinin (BrdU) alımı miktarının içerir. Buna ek olarak, metatars dokuların daha fazla işlem mRNA (RT-qPCR), protein ve hücre içi sinyal analizi (Western lekeleme) ya da lipit bileşimi (kütle spektrometrisi) aşağı doğru analize imkan vermek üzere gerçekleştirilebilir. Bugüne kadar çoğu araştırmalar doğum sonrası hayvanlardan kültür embriyonik metatarsallann yerine metatarsallann kullanın. daha hızlı büyümek ve explo olabilir: her iki model de bilgilendirici olabilir iken, embriyonik kemik çalışma birçok avantajı vardırkısıtlı erişim vardır mineralizasyon süreci 23-25 başlangıcı ve ilerlemesini incelemek için. Bu protokol ayrıntılı olarak embriyonik gün 15 (E15) fare embriyolarının arka bacak embriyonik metatarsallara karmaşık diseksiyonu açıklar. Ayrıca, anatomik farklı metatars büyüme ve mineralizasyonu gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500342</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #4 tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500339</td>
			<td>Autoclave sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFine Vannas scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E/0650DF/17</td>
			<td>Dilute to 70% v/v in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM without nucleosides</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters (0.22&#956;m) 33mm diameter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0378</td>
			<td>Add directly to the media prior to experimentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid-2-phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc cell-culture treated 24-well plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of murine embryonic metatarsals: a physiological model of endochondral ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

Bu yöntemin amacı, uzunlamasına kemik büyümesi ve ECM mineralizasyon incelenmesi için embriyonik metatarsallann ve kültürünü onları izole etmek oldu. ışık mikroskobu ile görüntülendi burada tarif edildiği gibi, bizim protokolünü kullanarak, embriyonik metatarsal kemikler başarıyla disseke edildi. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi yapılan metatarsal kemikleri, ölçümleri, bunların ECM boyuna uzunluğu büyüme ve mineralize etme kapasitelerini gösteren (Şekil 2 ve 3). Matrisin mineralizasyonu birinci kemik güdük orta diafizde not edilir ve kolay bir ışık mikroskobu ile görülür. kalseinin alımı yeni kurulan mineral gelişmiş görselleştirme sunabilir rağmen hiçbir boyama gereklidir. Bugüne 22,27,28 embriyonik metatarsallann kullanan Çalışmalar disseke 2 nd toplanmış olması, 3. ve 4. (central üç) metatars, in vitro büyüme ve mineralizasyonu varsayarak karşılaştırılabilir olması. fare metatarsallara in vivo gelişimsel, ancak, 3. ve 4. basamak öncesinde tüm diğer metatars ve falanks 29 mineralizasyon delil olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrı ayrı izole ve kültürlü E15 2 nd büyüme ve mineralizasyon potansiyelinin değerlendirilmesi, 3. ve 4. metatarslarda kültür 7 gün (Şekil 2) sonra mineralizasyon görünüm veya ölçüde farklılık gözlenmedi. başlangıca yüzde artış fark yok kültür döneminde bulunmuştur. Mineralizasyon potansiyelinde hiçbir fark belirtildiği gibi 2. 3. ve 4. metatarsallann havuzu standart protokol gelecekteki çalışmalar için geçerlidir görünür. Geleneksel olarak, araştırmacılar medyaya βGP ekledikECM mineralizasyon teşvik etmek, kültür embriyonik metatarsallara için kullanılır. Ancak, hücre kültürü çalışmalarda, TNAP enzimi βGP ihtiva osteojenik ortama ilave edilir ise, dış hidroksiapatit mineral tortulaşmasından dahi hücre 30 yokluğunda meydana geldiği gösterilmiştir. metatarsal mineralizasyonu yeteneği çeşitli mineralizasyon substratların ve agonistlerin etkilerini incelemek için, biz takviyeleri bir dizi içeren kültür ortamında E15 metatarsallann kültürlü ve görüntüleri ve uzunluk ölçümleri günlük olarak kaydedildi. Sonuçlar E15 metatarsal kemikler hala büyümek ve βGP yokluğunda kendi ECM mineralize belirtti. Metatarsalların βGP (Şekil 3) mevcudiyetinde kültürlenmiştir olarak askorbik asit içinde kültürlenmiş E15 metatarsal kemikleri yalnızca ortam uzunluk ve mineralizasyon karşılaştırılabilir artışlar göstermiştir. Ayrıca lentivirüs kültürlenmiş metata ekzojen DNA transfekte etmek için kullanılabilir olduğunu göstermiştirrsals. Burada başarılı metatarsal başına 2 x 10 6, yeşil floresan proteini (GFP) virüs partiküllerinin kültür (diseksiyon örneğin gün) 0. günde metatarsal kemikleri transfekte edildi. Virüs transdüksiyonunu etkinleştirmek için, polibren, aynı anda 1 kültürlere ilave edildi: 500. Kültürler konfokal mikroskop (kullanarak 4 ile kuluçkalanmıştır önce, ortaya E15 metatarsal mineralizasyonu için gereken şekilde, 5 dakika, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), leke &#39;Resim ortam değişiklikleri ile, 7 gün boyunca bırakıldı ve daha sonra, doğrudan görselleştirilmiştir Şekil 4). kavram deneylerin Bizim kanıtı açıkça etkili transdüksiyon göstermektedir. Ancak onların transfeksiyon ve etkili gen manipülasyonu değerlendirmek için metatarsal kemiğin bütünlüğü boyunca bölümlerini incelemek ihtiyatlı bir davranış olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> Şekil 1: Standart Metodoloji t Tedbir için kullanılanO Uzunluk ve Embriyonik metatarsallara mineralizasyonu Bölgesi. (A) kültür 0. günde E15 metatarsallara toplam uzunluğu ölçümleri (diseksiyon gün) metatarsal merkezi aracılığıyla çekilen. Kültür içinde yedi gün sonra, bir metatarsal toplam uzunluğunun (B) Ölçümleri. metatarsal hafif bir eğrilik edin. (C) kültüründe yedi gün sonra mineralizasyon zonu uzunluğu ölçümü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> E15 farelerin arka bacak w gelen Büyüme ve Anatomik Farklı E15 metatarsallardan Görüntüleme mineralizasyonu Kapasitesi ve 2. ölçümü, 3 ve 4 metatarslarda: Şekil 2.gerçekleştirildiği şekilde. (A) kültür dönemi boyunca 2., 3. ve 4. metatars seri görüntüler. Kültürlerin her gün gün 0 uzunluğu (B) yüzde artış. Kültür süresi boyunca 2., 3. ve 4. metatarsalların (C) mineral uzunluğu, toplam metatarsal uzunluğunun bir yüzdesi olarak ifade edilir. Veri, ortalama ± standart ortalama hatası (SEM) olarak ifade edilmiştir (n = 6). (D) Kültürün her gün C57Bl / 6J metatarsal uzunlukları. Veri temsil edilir, ortalama ± standart sapma (n = 6). Siyah çubuk = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> Şekil 3: Yabani-tip büyüme ve mineralizasyon KapasitesiÇeşitli osteojenik Medya E15 metatarsalların kültürlü. (A), yalnızca, askorbik asit, 1 mM βGP, 3 mM fosfokolin, 1.5 mM kalsiyum klorür veya ortam ihtiva eden 3 mM kalsiyum klorid içinde kültüre metatarsalların seri ve görüntüler. Metatarsalların 0. günden uzunluğu (B) yüzde artış, çeşitli takviyeleri ile kültürlendi. Çeşitli ortamında kültürlenir metatarsalların (C) mineral uzunluğu, toplam metatarsal uzunluğunun bir yüzdesi olarak ifade edilir. Veriler, ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) ile temsil edilmektedir (n = 6). Siyah çubuk = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> Şekil 4: GFP Virüs P E15 metatarsallara transfeksiyonumakaleler. (A) E15 metatarsal kemikleri kavramının kanıt gfp virüs partikülleri ile transfekte edilmiştir. (B) Kemikler, DNA görselleştirme için DAPI ile boyanmıştır. (C) Çift görüntüleri metatarsal kemiklerin bütünlüğü boyunca GFP virüs başarılı transfeksiyon göstermiştir. Beyaz barlar = 0.5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification at JoVE.com

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.0K Görüntüleme.  The University of Edinburgh. We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development. 

Video: Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...