SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi

Bu testin genel amacı, SARS-CoV-2, MERS, influenza A ve influenza B gibi yaygın olarak dolaşan solunum yolu virüslerinin aynı anda tespiti için çok yönlü bir yaklaşım uygulamaktır. LAMBA. Bununla birlikte, multipleks RT-qPCR en hassas, yaygın olanıdır ve çeşitli virüsleri teşhis etmek için altın standarttır. Mevcut deneysel zorluk, 10 kopya kadar düşük RNA kopyalarını tespit etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmaktır.

Tahlil için zaman ve maliyet etkin olan kurum içi RT-qPCR kitini kullandık. Başlamak için, DNA/RNA içermeyen suda RT-qPCR için 2x tamponu hazırlayın Tamponu daha fazla kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, primerleri ve probları 1.5 mililitrelik bir tüpte karıştırın.

Hacmi elüsyon tamponu ile doldurun, ardından tüpü eksi 20 santigrat derecede saklayın. Buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpte taq polimeraz ve MMLV-RT ile bir enzim karışımı hazırlayın. Taq polimeraz depolama tamponu ile hacmi oluşturun.

Şimdi, mikrolitre başına 10 ila altıncı RNA kopyası stokları yapmak için viral sentetik RNA'ları 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ile ayrı tüplerde yeniden süspanse edin. Virüs stoklarını karıştırmak için SARS-CoV-2, influenza A ve B'nin her birine beş mikrolitre ila 50 mikrolitre Tris-EDTA tamponu ekleyin. Benzer şekilde, ikinci bir viral karışım elde etmek için SARS-CoV-2 ve MERS-CoV'yi karıştırın.

Mikrolitre başına 10 RNA kopyasının nihai seyreltmesini elde etmek için her iki karışımı da on kat seyreltin. 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 2x tampon, astar, enzim, DNA/RNA içermeyen su ve karşılık gelen RNA karışımlarını pipetleyin. Plakayı yapışkan bir plaka contası ile kapatın.

Ardından, kuyu dibindeki sıvıyı toplamak için plakayı bir dakika santrifüjleyin. Daha sonra PCR makinesini, deney tipi standart eğriye ayarlanmış hızlı 96 kuyulu blok tipini kabul edecek şekilde programlayın. Reaktifleri TaqMan reaktifleri olarak ayarlayın ve standart çalıştırma özelliklerini seçin.

Gen hedeflerini ve raportör boyayı tanımlayın. Ardından, test edilecek her reaksiyon için numune adlarını tanımlayın ve plaka düzenine hedefler ve numuneler atayın. Şimdi döngü programını cihaza girin.

Plakayı gerçek zamanlı QPCR makinesine doğru yönde aktarın ve döngüyü başlatmak için çalıştır düğmesine basın. Deneysel verileri kaydetmek için dosya konumunu seçin. Ardından QPCR programı tarafından sağlanan amplifikasyon grafiklerini inceleyin.

Geliştirilen iki kit, reaksiyon başına 10 RNA kopyası kadar düşük bir miktarla, üç hedef genin tümünü aynı anda başarılı bir şekilde çoğaltabildi. Tüm viral titrasyonlar için amplifikasyon verimlilikleri %99'un üzerindeydi